雞爪槭(Acer palmatum Thunb.)品種‘赤楓’組培再生體系的建立

馬建華, 朱曉菲, 何程相, 丁龍梅, 向明劍,黃良偉, 姜良珍, 謝松林*

(1.四川七彩林科股份有限公司研究院, 四川省名特優(yōu)新彩色苗木繁育工程實驗室, 四川 巴中 635600;2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院, 成都 610106)

雞爪槭‘赤楓’(Acerpalmatumc.v.‘Sango kaku’)是槭樹科雞爪槭組的一個園藝品種，又名‘珊瑚閣’，1882年培育而成[1]。‘赤楓’為落葉小喬木，新枝紅色；單葉對生，掌狀5～7裂，裂片披針形，先端銳尖，邊緣具細鋸齒；其嫩葉橙黃色，裂片周圍具有鑲邊狀紅色邊暈?！鄺鳌荒晁募揪休^高觀賞價值，其春葉綠色，夏葉漸漸變?yōu)辄S綠色，秋天葉子變?yōu)辄S色或赤茶色，冬天落葉后枝條紅色[2]，是近年來廣受歡迎的園林綠化新興樹種。

在‘赤楓’苗木生產(chǎn)過程中，一般采用嫁接繁殖。田曉明等[3]對‘赤楓’嫁接技術(shù)進行深入研究，建立了適宜于‘赤楓’的嫁接方式，成活率達70%以上。嫁接繁殖能迅速形成工程苗，但因其繁殖材料及嫁接季節(jié)受外界環(huán)境影響較大，繁殖系數(shù)低，不利于規(guī)模化種苗生產(chǎn)。組培繁殖技術(shù)不受外界環(huán)境因素影響、繁殖系數(shù)高，能迅速擴繁產(chǎn)生大量種苗。然而，國內(nèi)外對‘赤楓’組培繁育技術(shù)研究鮮有報道。國外在雞爪槭體細胞胚胎發(fā)生[4]、形態(tài)分布[5]、栽培措施[6]等方面進行了研究，關(guān)于組培繁殖僅見尖尾槭[7]及雞爪槭砧木[8]等同科植物組培技術(shù)報道。國內(nèi)相關(guān)技術(shù)研究中，僅有李倩中等[9]對雞爪槭‘金陵黃楓’的組培繁殖技術(shù)進行了細致研究，此外，研究人員對復(fù)葉槭、紅翅槭、金葉復(fù)葉槭、自由人槭等同科植物的組培繁殖技術(shù)進行了相關(guān)研究[10-13]。

本研究以‘赤楓’莖段為外植體，通過組織培養(yǎng)各環(huán)節(jié)因素篩選，以期建立‘赤楓’組培快繁技術(shù)體系，填補‘赤楓’組培繁殖技術(shù)研究空白，為工廠化育苗及后期規(guī)?；藿臃敝臣斑M一步研究提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘赤楓’健康無病害枝條采集于四川七彩林科股份有限公司品種資源圃。益培隆組織培養(yǎng)高效抗污殺菌劑，其他試劑為國產(chǎn)分析純，均購自于北京康倍斯科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體處理及培養(yǎng)條件 于2013年2—11月，分別采集‘赤楓’莖段外植體。用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌10 min，無菌水清洗5遍后，接種于MS+0.2 mg· L-1IAA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)間環(huán)境光/暗為16 h /8 h，光照3 000 lx，溫度(25±1) ℃，濕度50%±10%的條件下進行培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計污染率及萌發(fā)率,篩選最佳外植體采集月份。

通過上述試驗獲得最佳采集月份后，在75%乙醇處理30 s,再用0.1%升汞滅菌10 min的基礎(chǔ)滅菌方式下，進一步進行不同方式的滅菌處理。分別采用50%多菌靈400倍液浸泡1 h的預(yù)處理、培養(yǎng)基中加入益培隆、益培隆滅菌前后浸泡1 h三種處理方式。

1.2.2啟動培養(yǎng) 將經(jīng)過滅菌處理的外植體分別接種到含有不同6-BA、NAA、KT、IAA配比的MS培養(yǎng)基中。接種30 d后，觀察腋芽生長狀況，統(tǒng)計芽誘導(dǎo)率，篩選最佳啟動培養(yǎng)基。

芽誘導(dǎo)率=腋芽萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%

1.2.3增殖培養(yǎng) 將啟動培養(yǎng)萌發(fā)出的2～3 cm長的腋芽剪下，轉(zhuǎn)接于添加不同6-BA、NAA、TDZ、IAA配比的MS培養(yǎng)基中。40 d后統(tǒng)計增殖率及增殖系數(shù)，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。

增殖率=產(chǎn)生叢生芽的腋芽數(shù)/轉(zhuǎn)接總腋芽數(shù)×100%

增殖系數(shù)=產(chǎn)生叢生芽單芽數(shù)/轉(zhuǎn)接總腋芽數(shù)×100%

1.2.4生根培養(yǎng) 選擇叢生芽上約2～3 cm左右且生長健壯的單芽，轉(zhuǎn)接入添加不同IBA、NAA、IAA配比的1/2MS培養(yǎng)基中。30 d后統(tǒng)計不定芽苗的生根狀況。

生根率=生根單芽數(shù)/轉(zhuǎn)接總單芽數(shù)×100%

1.2.5煉苗移栽 把經(jīng)過不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)后根系狀態(tài)良好、生長健壯、長約5～7 cm的‘赤楓’組培苗轉(zhuǎn)移到溫室大棚中煉苗。煉苗環(huán)境保持干凈，煉苗前適當(dāng)噴灑多菌靈。通過不同的閉瓶煉苗和開瓶煉苗時間后煉苗移栽。煉苗時洗凈組培苗上的培養(yǎng)基，移栽進珍珠巖、蛭石、草炭土、泥沙等不同配比的基質(zhì)中。煉苗環(huán)境溫度(25±4) ℃，濕度80%±20%，用遮陽網(wǎng)遮蓋，避免正午陽光直射。30 d后統(tǒng)計煉苗成活率，篩選最佳煉苗時間及煉苗基質(zhì)。

煉苗成活率=成活植株數(shù)/移栽總植株數(shù)×100%

1.2.6數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理采用Excell軟件，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動培養(yǎng)

2.1.1外植體采集季節(jié)選擇 不同月份(外植體滅菌條件和培養(yǎng)條件均相同)采集的外植體在啟動培養(yǎng)時污染結(jié)果統(tǒng)計如表1所示，可以看出，在全年采集外植體試驗中，各月份之間的污染率差異顯著，3月和11月的外植體污染率較高，6月污染率最低。從外植體腋芽萌發(fā)率看，10月份最高，但污染率也高。6月萌發(fā)率較低，但與的7、8、9、11月的差異不顯著，且污染率最低。因此，選擇6月為外植體采集的最佳時期。

表1 外植體采集時間對‘赤楓’外植體污染和萌發(fā)的影響Table 1 Effects of sampling time on pollution and germination of ‘Sango kaku’ explants

2.1.2外植體滅菌處理 將6月采集的外植體用不同方式進行滅菌處理，結(jié)果如表2所示，‘赤楓’枝條經(jīng)50%多菌靈400倍液浸泡1 h后再進行常規(guī)的乙醇+升汞的滅菌處理能顯著降低‘赤楓’外植體的污染率，且能保持較高的腋芽萌發(fā)率。因此，‘赤楓’外植體滅菌的最佳處理方式為：50%多菌靈400倍液浸泡1 h后， 75%乙醇滅菌30 s，最后0.1%升汞滅菌處理10 min。

表2 不同滅菌處理方式對‘赤楓’外植體污染和萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different sterilization treatments on the pollution and germination of ‘Sango kaku’ explants

2.1.3啟動培養(yǎng)基的選擇 將滅菌后的帶芽莖段接種于不同的培養(yǎng)基中進行外植體啟動培養(yǎng)。挑出長菌污染莖段后，統(tǒng)計其萌發(fā)率，結(jié)果(表3)表明，MS基本培養(yǎng)基添加單種激素對‘赤楓’枝條萌發(fā)率的影響顯著優(yōu)于添加多種激素。單種激素添加的萌發(fā)率在66.6%～92.1%之間；兩種激素混合添加的萌發(fā)率在40.2%～64.8%之間；三種激素混合添加的萌發(fā)率在51.9%；四種激素混合添加的萌發(fā)率在54.0%。單種激素的對比中， IAA的效果顯著優(yōu)于其他激素，萌發(fā)率達到90%以上。因此，‘赤楓’外植體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-1IAA。

表3 不同激素對‘赤楓’外植體啟動培養(yǎng)的影響Table 3 Effects of different hormones on the initiation culture of ‘Sango kaku’ explants

2.2 增殖培養(yǎng)

腋芽在各增殖培養(yǎng)基中生長40 d后，觀察產(chǎn)生叢生芽的節(jié)段數(shù)量，統(tǒng)計分化率和增殖系數(shù)。由表4可知，不同激素組合的MS培養(yǎng)基上‘赤楓’的增殖率和增殖系數(shù)差異明顯。6-BA和IAA組合的分化率在87.0%～96.0%之間，增殖系數(shù)在3.0～6.0之間；TDZ和IAA的組合分化率在59.7%～90.9%之間，增殖系數(shù)在2.1～3.9之間；6-BA和NAA組合的增殖率為50.9%，增殖系數(shù)為3.8；TDZ和NAA組合的增殖率為71.5%，增殖系數(shù)為2.2。其中，‘赤楓’在添加了2.0 mg·L-1的6-BA和0.5 mg·L-1IAA培養(yǎng)基上不定芽分化率達到96%，增殖系數(shù)為6.0，均顯著高于其他培養(yǎng)基，且在此培養(yǎng)基上生長的叢生芽狀態(tài)較好，更加有利于下一步繼代培養(yǎng)。因此，‘赤楓’增殖的最佳培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA。

表4 不同激素對‘赤楓’腋芽增殖的影響Table 4 Effects of different hormones on the proliferation of ‘Sango kaku’ axillary buds

2.3 生根培養(yǎng)

對‘赤楓’不定芽在不同培養(yǎng)基中的生根情況進行調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果(表5)表明，不同激素的培養(yǎng)基上‘赤楓’不定芽苗的生根狀況顯著不同。添加IBA培養(yǎng)基上，赤楓不定芽苗的生根率在55.1%～75.6%之間，平均生根條數(shù)在1.2～2.9之間，新生根較為細長；添加NAA的培養(yǎng)基上生根率在75.9%～95.4%之間，平均生根條數(shù)在2.2～3.5之間，新生根較為粗壯；不同激素配比的培養(yǎng)基上生根率則在60%上下，平均生根條數(shù)在1.9～2.7之間，新生根較為粗壯且?guī)в杏鷤＞C合生根率以及根系生長狀況，‘赤楓’最佳生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+0.3 mg·L-1NAA。

表5 不同激素對‘赤楓’不定芽苗生根的影響Table 5 Effects of different hormones on rooting of adventitious sprouts of ‘Sango kaku’

2.4 煉苗移栽

2.4.1煉苗時間 不同煉苗時間處理下，‘赤楓’組培苗的成活情況如表6所示：隨著閉瓶煉苗和開瓶煉苗天數(shù)的增加，成活率顯著上升，煉苗后的馴化苗健壯程度也呈上升趨勢。其中閉瓶煉苗6 d，開瓶煉苗3 d能使成活率達到93%，植株健壯；閉瓶6～10 d，開瓶3～5 d成活率穩(wěn)定，植物狀態(tài)穩(wěn)定；再增加煉苗天數(shù)，成活率降低。因此，‘赤楓’最佳煉苗時間為：閉瓶煉苗6 d，開瓶煉苗3 d。

表6 不同煉苗時間對煉苗成活率的影響Table 6 Effects of different refining time on survival rate of refining seedlings

2.4.2煉苗基質(zhì) 將煉苗后的‘赤楓’，移栽進不同的基質(zhì)中，成活情況見表7?？梢钥闯?，不同移栽基質(zhì)對雞爪槭‘赤楓’組培苗的移栽成活率有顯著影響，基質(zhì)混合使用的效果顯著優(yōu)于單獨使用。其中，單種基質(zhì)的移栽成活率在73.3%～82.0%之間，馴化苗植株偏黃；兩種基質(zhì)混合添加的移栽成活率在80.0%～86.7%之間，馴化苗植物生長健壯，其中,草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1混合基質(zhì)的栽培效果相對較好，平均成活率達90.5%，馴化苗植株青綠。因此，‘赤楓’煉苗的最佳基質(zhì)是草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1的混合基質(zhì)。

表7 不同基質(zhì)對‘赤楓’組培煉苗成活率的影響Table 7 Effects of different substrates on the survival rate of ‘Sango kaku’ seedlings

2.5 組培苗生長情況

本研究通過誘導(dǎo)莖段腋芽萌發(fā)，轉(zhuǎn)接萌發(fā)的腋芽誘導(dǎo)叢生芽實現(xiàn)增殖，切割叢生芽單芽進行生根培養(yǎng)，建立了雞爪槭‘赤楓’組培繁育技術(shù)體系，組培苗生長狀態(tài)良好，根系發(fā)達、健壯(圖1)。

A:啟動腋芽萌發(fā)；B: 增殖產(chǎn)生叢生芽；C: 生根苗；D: 生根根系A(chǔ): Axillary bud germination; B: Proliferation to produce cluster buds; C: Rooting seedlings; D: Roots圖1 ‘赤楓’組培過程中形態(tài)Fig.1 Phenotype of tissue culture during process

3 討論

本試驗通過研究建立了赤楓組培繁殖再生技術(shù)體系，以6月采集的‘赤楓’帶芽莖段為外植體，經(jīng)50%多菌靈400倍液浸泡1 h 后，以75%乙醇30 s+0.1%升汞10 min的滅菌，接種到MS+0.5 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，切割萌發(fā)的單芽，轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽增殖，切割不定芽苗轉(zhuǎn)接于1/2MS+0.3 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。組培生根苗閉瓶煉苗6 d，開瓶煉苗3 d后，移栽到草炭：蛭石：珍珠巖=1:1:1的基質(zhì)中進行馴化移栽，成活率可達90%。另外，培養(yǎng)基中添加0.3 g·L-1的活性炭可抑制培養(yǎng)材料的褐化。

外植體污染是組培過程的常見問題[14]。本研究使用常規(guī)滅菌劑乙醇和升汞能在一定程度上控制污染率，這與前人研究結(jié)果一致[14-15]。除此之外，本試驗對最佳外植體的采集月份進行了試驗，結(jié)果證明，外植體最佳采集時間是全年中的6月，這與紅翅槭[11]和自由人槭[13]的外植體采集時間一致。2月、3月外植體污染率較高，這可能是因為接種的外植體為冬枝，自身帶菌嚴(yán)重；而7月以后污染率升高的原因可能是進入雨季，濕度加大導(dǎo)致外植體帶菌較多。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物組培成功有決定性影響。植物種類、器官不同，適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及搭配比例不同[16-18]。本試驗采用激素6-BA和IAA的組合實現(xiàn)了對雞爪槭‘赤楓’腋芽的增殖，這與復(fù)葉槭[10]、紅翅槭[11]、尖尾槭[7]的研究結(jié)果一致，但在使用濃度上存在差異。本研究使用激素NAA實現(xiàn)了雞爪槭‘赤楓’的生根培養(yǎng)，與雞爪槭‘金陵黃楓’[9]和復(fù)葉槭[10]的生根培養(yǎng)研究結(jié)果一致，但在使用濃度上存在差異。本試驗在啟動培養(yǎng)中，單種激素的添加優(yōu)于多種激素的添加，這可能是外植體枝條本身儲存了部分營養(yǎng)及激素，外植體的萌發(fā)多半依賴于自身的激素條件，多種激素的添加反而抑制其生長或者使枝條過多分化愈傷組織，從而降低了萌發(fā)率。

前人對槭樹科的同科植物組培技術(shù)研究中，使用了器官發(fā)生[12]、愈傷組織誘導(dǎo)[11]、體細胞胚誘導(dǎo)[7]等途徑實現(xiàn)離體再生。本試驗采用腋芽誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生途徑，與李倩中等[9]對雞爪槭‘金陵黃楓’的誘導(dǎo)方式相似。李艷敏等[12]通過器官發(fā)生途徑實現(xiàn)了金葉復(fù)葉槭的增殖，增殖系數(shù)為3.11，本試驗通過誘導(dǎo)叢生芽，增殖系數(shù)最高為6.0。

褐化是植物組織培養(yǎng)中的三大難題之一，而木本植物本身富含單寧、木質(zhì) 素、色素等物質(zhì)，褐化較之草本植物嚴(yán)重[19-20]。招雪晴等[13]在對自由人槭的防褐化中采用了外植體取材部位的試驗處理。在組織培養(yǎng)的各個時期，‘赤楓’均有不同程度的褐化出現(xiàn)。為克服褐化現(xiàn)象，本研究還在試驗過程中對比了不同抗褐化劑對‘赤楓’組培過程中褐化現(xiàn)象的抑制作用。試驗結(jié)果顯示，不同抗褐化劑都能在一定程度上抑制褐化，VC、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉的抑制效果較為相似，抑制效果較輕；檸檬酸和PVP的抑制效果較為相似，稍優(yōu)于VC、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉的抑制效果；其中添加0.3 g·L-1的活性炭效果最為明顯。

李艷敏等[12]對金葉復(fù)葉槭的煉苗時間研究結(jié)果是閉瓶煉苗4～5 d，開瓶煉苗1～2 d。本試驗煉苗時間略高于此，閉瓶煉苗6 d，開瓶煉苗3 d后具有最高的煉苗成活率。在煉苗基質(zhì)方面，金葉復(fù)葉槭[12]使用蛭石的煉苗成活率在90%左右，紅翅槭[11]使用蛭石：珍珠巖=1:1的基質(zhì)，煉苗成活率在95%以上，本試驗采用草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1混合基質(zhì)的栽培效果相對較好，其平均成活率達90%。這可能與‘赤楓’的生長特性有關(guān)，其嗜中性偏酸的排水性良好的肥沃土壤，而蛭石偏堿，故對‘赤楓’的生長有一定的影響。

本研究建立‘赤楓’組培繁育技術(shù)體系，進一步豐富了國內(nèi)對雞爪槭組培的研究成果。為進一步工廠化育苗提供了技術(shù)支撐，同時，研究成果將為‘赤楓’進一步分子育種及遺傳改良研究奠定基礎(chǔ)。