cry1A基因通用檢測(cè)方法的建立

董美， 胡曉穎， 孟麗霞， 宛煜嵩， 劉衛(wèi)曉， 金蕪軍， 李亮

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

隨著轉(zhuǎn)基因植物不斷地商業(yè)化種植與加工，加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的安全監(jiān)管也顯得日益突出[1-3]。針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物建立特異、靈敏的檢測(cè)方法是轉(zhuǎn)基因植物安全監(jiān)管的重要技術(shù)支撐。目前，國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法以定性PCR為主，僅農(nóng)業(yè)農(nóng)村部就發(fā)布了170余項(xiàng)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，包括篩選檢測(cè)、基因特異性檢測(cè)、構(gòu)建特異性檢測(cè)和轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)[4]。其中，轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)具有高度的特異性[5-7]，而基因特異性檢測(cè)可以檢測(cè)出所轉(zhuǎn)該外源基因的產(chǎn)品，不受整合位點(diǎn)和插入時(shí)載體片段缺失等因素的干擾，應(yīng)用尤其廣泛。

Bt基因來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)，因其表達(dá)產(chǎn)物Bt毒蛋白具有抗蟲(chóng)效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)使得其成為國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的抗蟲(chóng)外源基因[8-10]，包括cry1A、cry2Ab、cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab等。其中使用頻次最高、應(yīng)用最為廣泛的抗蟲(chóng)基因是cry1A基因，包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、cry1Ab/Ac等[11-12]。因此，以cry1A基因作為靶標(biāo)的通用檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)基因植物安全監(jiān)管中具有極高的應(yīng)用性。國(guó)內(nèi)外已建立了幾種針對(duì)cry1A基因的檢測(cè)方法[13-14]，但是，由于不同轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化體中的cry1A類基因在核苷酸序列上有很大的變異性，已有方法僅適用于極少數(shù)轉(zhuǎn)化體，適用范圍窄，亟需建立新的方法。因此，本文以含有cry1A基因的不同作物及其主要的商業(yè)化轉(zhuǎn)化體進(jìn)行測(cè)試，建立cry1A基因特異、靈敏的定性PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 植物樣品與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自歐洲標(biāo)準(zhǔn)局(IRMM)，轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因循環(huán)驗(yàn)證樣品由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供，其余部分樣品為實(shí)驗(yàn)室保存樣品，以上樣品均為植物粉末。

植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)購(gòu)自天根生化科技(北京)生物技術(shù)有限公司；GoTaq?Green Master Mix(M7123)購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取和純化 利用植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)植物粉末樣品提取DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取的DNA溶液稀釋至25 ng·μL-1備用。

1.2.2引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化 通過(guò)查詢網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)、國(guó)內(nèi)外專利、科技文獻(xiàn)等方式，對(duì)含有cry1A基因的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行序列分析，確定了含有cry1A基因的16種轉(zhuǎn)基因作物材料(表1)。根據(jù)資料上提供的序列，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證，再次明確不同轉(zhuǎn)化體中cry1A基因的序列。利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用Primer premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。采用簡(jiǎn)并引物策略并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選cry1A基因定性PCR檢測(cè)引物。

1.2.3PCR擴(kuò)增體系和條件優(yōu)化 根據(jù)篩選出的最佳引物組合，調(diào)整優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系中引物的終濃度，設(shè)置0.1、0.2、0.4、0.8 μmol·L-1共4個(gè)濃度梯度，并以58、60、62、64、66、68 ℃為退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：GoTaq?Green Master Mix緩沖液12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物根據(jù)上述引物終濃度確定，25 ng·μL-1DNA模板2 μL，用去離子水補(bǔ)至25 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.4特異性驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序，選取特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣品33種對(duì)方法進(jìn)行特異性測(cè)試(含有cry1A基因樣品16種，不含cry1A基因及其他樣品17種)。

特異性驗(yàn)證樣品包括以下類型：(1)含cry1A基因的材料(表1)；(2)不含cry1A基因的材料(部分含其他抗蟲(chóng)基因)：MON863(cry3Bb1)、MON88017(cry3Bb1)、MIR604(cry3A)、TC1507(cry1F)、MIR162(vip3Aa20)、59122(cry34Ab1、cry35Ab1)、4114(cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1)、MON87460、NK603、GA21、3272、T25；(3)非轉(zhuǎn)基因混合材料：非轉(zhuǎn)基因油菜、水稻、大豆、玉米、棉花5種混合樣品，每種作物各選取5個(gè)非轉(zhuǎn)基因材料等量混合制成1個(gè)樣品。

1.2.5方法檢出限測(cè)試 對(duì)含有cry1A基因的3種材料(Bt11、MON810、Bt176)，使用購(gòu)買的歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品進(jìn)行測(cè)試，確定方法檢出限。歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每種材料包含以下濃度：轉(zhuǎn)基因玉米Bt11(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.89%、1.96%、0.98%、0.49%、0.098%、<0.012%)；轉(zhuǎn)基因玉米MON810(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.9%、1.98%、0.49%、<0.09%)；轉(zhuǎn)基因玉米Bt176(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.0%、2.0%、1.0%、0.5%、0.1%、<0.014%)。對(duì)可檢出最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)試樣品，提取60份基因組DNA進(jìn)行檢出限測(cè)試。若60份測(cè)試樣品中不少于59份測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性，則將該樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為方法的相對(duì)檢出限。

1.2.6實(shí)驗(yàn)室間循環(huán)驗(yàn)證 選擇7家第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)該方法進(jìn)行特異性檢測(cè)、檢出限測(cè)試和重演性分析。參加循環(huán)驗(yàn)證的7家單位分別是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全及植物抗性監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(哈爾濱)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長(zhǎng)春)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(杭州)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(天津)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(天津)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因植物及植物用微生物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(廣州)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)及引物設(shè)計(jì)

利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，這些基因盡管屬于同一類群，但核苷酸序列存在較大差異，保守部分區(qū)域較少。利用Primer premier 5.0 軟件先后設(shè)計(jì)了26對(duì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)序列比對(duì)分析的結(jié)果，選擇cry1A基因序列差別較大的3個(gè)品系轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、轉(zhuǎn)基因玉米MON810進(jìn)行簡(jiǎn)并引物的篩選。

由于使用的是簡(jiǎn)并引物，不同的測(cè)試對(duì)象擴(kuò)增效果存在明顯差異(未列出)。引物對(duì)0516-F2(cry1A-F): 5′-C ART T C A A C G A C A T G A A C A G C GC-3′、0516-R4(cry1A-R)：5′-G C T C C A G G C CVG T G T T G T A C CA-3′，擴(kuò)增片段253 bp，對(duì)測(cè)試對(duì)象的擴(kuò)增條帶清晰、特異性高，擴(kuò)增效率一致，確定此引物對(duì)為研究對(duì)象，進(jìn)行各類參數(shù)測(cè)試。

2.2 PCR擴(kuò)增體系和條件優(yōu)化

通過(guò)引物濃度和退火溫度的正交測(cè)試(圖1)，確定引物終濃度0.4 μmol·L-1，退火溫度64 ℃，此條件下PCR擴(kuò)增效率高、非特異性好、引物二聚體少。

2.3 特異性分析

特異性驗(yàn)證結(jié)果(圖2)顯示，僅從含有cry1A基因的材料中獲得預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，而從其他樣品中未獲得預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，表明方法特異性符合要求。此外，上述不含cry1A基因的材料中包含了部分Bt基因的其他類別，實(shí)驗(yàn)時(shí)均未獲得擴(kuò)增，表明方法對(duì)cry1A基因特異性良好，可以用于cry1A基因的特異性檢測(cè)。

A、B、C、D分別表示引物終濃度的4個(gè)梯度：0.1、0.2、0.4、0.8 μmol·L- 1；1 & 2、5 & 6、9 & 10、13 & 14、17 & 18、21 & 22分別表示陰性玉米的6個(gè)退火溫度梯度：58、60、62、64、66、68 ℃；3 & 4、7 & 8、11 & 12、15 & 16、19 & 20、23 & 24分別表示MON810的6個(gè)退火溫度梯度：58、60、62、64、66、68 ℃；M為100 bp DNA Ladder。A, B, C, D show reactions in which the primer concentration are 0.1, 0.2,0.4, 0.8 μmol·L- 1, respectively; lanes 1 & 2, 5 & 6, 9 & 10, 13 & 14, 17 & 18, 21 & 22 show reactions in which the annealing temperature of negative maize are 58, 60, 62, 64, 66, 68 ℃, respectively; lanes 3 & 4, 7 & 8, 11 & 12, 15 & 16, 19 & 20, 23 & 24 show reactions in which the annealing temperature of MON810 maize are 58, 60, 62, 64, 66, 68 ℃, respectively; lane M is 100 bp DNA Ladder.圖1 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of the primer concentration and the annealing temperature

A：含cry1A基因材料測(cè)試結(jié)果；M為100 bp DNA Ladder，1～18分別為Bt11、MON89034、Bt176、DAS-81419-2、C0030.3.5、SK12-5、Bt506、MON88017、MON810、MON531、MON15985、T304-40、Kefeng 6、KMD、TT51-1、Kefeng 8、陰性玉米、空白對(duì)照。B：不含cry1A基因材料測(cè)試結(jié)果；M為100 bp DNA Ladder，1～15分別為空白對(duì)照、陰性玉米、陽(yáng)性對(duì)照(MON810)、MON863、MON88017、MIR604、TC1507、MIR162、59122、4114、MON87460、NK603、GA21、3272、T25。C：不含cry1A基因混合材料測(cè)試結(jié)果；1～8分別為油菜混合樣、水稻混合樣、大豆混合樣、玉米混合樣品、棉花混合樣品、陽(yáng)性對(duì)照(MON810)、陰性玉米、空白對(duì)照。A: Result of materials containing cry1A gene; M is 100 bp DNA Ladder; lanes 1～18 are Bt11, MON89034, Bt176, DAS-81419-2, C0030.3.5, SK12-5, Bt506, MON88017, MON810, MON531, MON15985, T304-40, Kefeng 6, KMD, TT51-1, Kefeng 8, negative maize, NTC (no-template control). B: Test result of materials excluding cry1A gene; M is 100 bp DNA Ladder, lane 1～15 are NTC (no-template control), negative maize, positive control(MON810), MON863, MON88017, MIR604, TC1507, MIR162, 59122, 4114, MON87460, NK603, GA21, 3272, T25. C: Test result of mixed materials excluding cry1A gene; lane 1～8 are the mixed samples of canola, rice, soybean, maize, cotton, positive control(MON810), negative maize, NTC (no-template control).圖2 引物特異性驗(yàn)證Fig.2 Specificity of the primer pair

2.4 方法檢出限分析

歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Bt11(0.098%)、MON810(<0.09%)Bt176(0.1%)均能穩(wěn)定檢出，對(duì)可檢出的最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)試樣品，60次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均有擴(kuò)增條帶，確定方法的檢出限為0.1%(部分結(jié)果見(jiàn)圖3)。

A：不同Bt176樣品用量結(jié)果；1～6分別為5%、2%、1%、0.5%、0.1% 和<0.014% Bt176樣品； 7為空白對(duì)照。B：0.1% Bt176樣品60次重復(fù)實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果；1～12為 0.1% Bt176, 13為陽(yáng)性對(duì)照(1.0% Bt176)，14為陰性玉米；15為空白對(duì)照。A: Result of different content of Bt176 samples; 1～6 are 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, <0.014% Bt176 samples, respectively; 7, NTC (no-template control);B： Partial result of 60 replicate with a Bt176 mass fraction of 0.1%; 1～12 are 0.1% Bt176 samples; 13 is positive control (1.0% Bt176); 14 is negative maize, lane 15 is NTC (no-template control).圖3 轉(zhuǎn)基因玉米Bt176對(duì)方法檢出限測(cè)試Fig.3 Results of LOD using genetically modified maize Bt176

2.5 實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性分析

實(shí)驗(yàn)室間循環(huán)驗(yàn)證測(cè)試樣品由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心委托農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長(zhǎng)春)制備，包括特異性樣品、靈敏度樣品及非轉(zhuǎn)基因混合樣品。特異性樣品為上述1%的16種材料；靈敏度樣品為0.1% MON810玉米，0.1% MON87701大豆，0.1% TT51-1水稻，0.1% MON531棉花；非轉(zhuǎn)基因混合樣品包括非轉(zhuǎn)基因玉米混合樣、非轉(zhuǎn)基因大豆混合樣、非轉(zhuǎn)基因苜蓿混合樣、非轉(zhuǎn)基因油菜混合樣。以上樣品涵蓋了常見(jiàn)的作物類型。

7家單位的復(fù)核驗(yàn)證結(jié)果顯示，僅從含有cry1A基因轉(zhuǎn)化體的樣品中擴(kuò)增獲得預(yù)期DNA片段，而在其他樣品中未獲得預(yù)期片段。驗(yàn)證結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)同行實(shí)驗(yàn)室的循環(huán)驗(yàn)證，本研究建立的cry1A基因通用PCR檢測(cè)方法具有高度的特異性，檢出限為0.1%。

7家驗(yàn)證單位的多次重復(fù)試驗(yàn)均獲得一致性結(jié)果，表明本標(biāo)準(zhǔn)方法具有很好的再現(xiàn)性，符合科學(xué)性、先進(jìn)性和可操作性的原則，能夠滿足轉(zhuǎn)基因植物及其制品中cry1A基因成分的定性PCR檢測(cè)的需要。

3 討論

在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)過(guò)程中，PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，應(yīng)用最為廣泛。目前，轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)首先要進(jìn)行基因特異性篩查[4, 15-16]，而cry1A基因作為主要的篩查元件在轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、棉花的檢測(cè)中被廣泛使用[8, 11, 17]。由于cry1A基因在使用時(shí)，研發(fā)者通常進(jìn)行一些改造，以提高抗蟲(chóng)效果。建立轉(zhuǎn)基因植物中cry1A基因通用檢測(cè)方法，最主要的問(wèn)題是篩選通用性強(qiáng)、特異性好、靈敏度優(yōu)的引物。國(guó)家質(zhì)檢總局于2012年發(fā)布實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法》(SN/T 1196—2012)[18]中包含了一種可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中cry1Ab基因的定性PCR方法，但該方法僅適用于Bt176等個(gè)別轉(zhuǎn)cry1A類轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也發(fā)布了關(guān)于cry1A類的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，包括《抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)Bt基因水稻定性PCR方法》(農(nóng)業(yè)部953號(hào)公告-6-2007)和《抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)Bt基因棉花定性PCR方法》(農(nóng)業(yè)部1 485號(hào)公告-11-2010)，其中Bt基因的檢測(cè)方法與SN/T 1196—2012相同，在轉(zhuǎn)基因成分的篩查中適用性較差[19-20]。

本研究過(guò)程中，通過(guò)不同植物中cry1A基因序列的比對(duì)，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物個(gè)別堿基采用簡(jiǎn)并堿基的方式，以提高檢測(cè)方法的通用性[11]。通過(guò)篩選得到最佳引物組合，再進(jìn)行穩(wěn)健性測(cè)試，包括引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，目的是在一定的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)(例如加樣誤差、PCR儀的溫度波動(dòng))均能獲得預(yù)期的擴(kuò)增。隨后，采用優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件，選取不同作物，不同轉(zhuǎn)化體進(jìn)行方法特異性測(cè)試。本方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，大豆DAS-81419-2和玉米bt506在引物結(jié)合處堿基錯(cuò)配位點(diǎn)較多，檢出限附近的測(cè)試結(jié)果稍差，但仍能滿足監(jiān)管與檢測(cè)要求。該檢測(cè)方法只能從含有cry1A基因的材料中檢測(cè)到目的片段，而在其他相似的材料中無(wú)法檢測(cè)到，并且也不會(huì)被這些相似物干擾，證明了該檢測(cè)方法具有100%的選擇性。檢出限是判斷轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)方法適用性的另一個(gè)重要技術(shù)指標(biāo)，反映了因特定分析物含量變化引起的檢測(cè)結(jié)果變化。檢出限一般定義為在不低于95%的檢出情況下的轉(zhuǎn)基因含量，嚴(yán)格的測(cè)試實(shí)驗(yàn)是在60個(gè)平行中至少檢出59次陽(yáng)性，并將這個(gè)最低含量定為方法檢出限[21]。實(shí)驗(yàn)采用了3種cry1A基因差異明顯的轉(zhuǎn)基因有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢出限均可達(dá)到0.1%，符合定性PCR檢測(cè)的要求。

實(shí)驗(yàn)室間循環(huán)驗(yàn)證是邀請(qǐng)7家國(guó)內(nèi)具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)特異性和靈敏度的循環(huán)驗(yàn)證，目的是驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性[22]。向參與本項(xiàng)工作的其他實(shí)驗(yàn)室以盲樣的形式分發(fā)均勻、穩(wěn)定、已知準(zhǔn)確濃度的樣品，各實(shí)驗(yàn)室用統(tǒng)一規(guī)定的方法對(duì)盲樣進(jìn)行測(cè)試[23-26]。循環(huán)驗(yàn)證結(jié)果表明，本研究建立的cry1A基因檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該方法可以作為cry1A基因檢測(cè)的通用檢測(cè)方法，為轉(zhuǎn)基因監(jiān)管提供服務(wù)。