板栗腐爛病小刺青霉菌(Penicillium spinulosum)培養(yǎng)條件及藥劑篩選

王俊鳳，溫曉蕾，孫偉明，劉一健，時路亭，張娜娜，楊文杰，陳衛(wèi)東，齊慧霞*

(1.河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北 秦皇島 066600；2.河北大學生命科學學院，河北 保定071002；3.河北省唐山市遷西縣林業(yè)局，河北 唐山 064300)

中國各地區(qū)都有板栗分布，在我國栽培面積廣泛，面積達180萬hm2，總產量195萬t，是世界上主要生產國之一[1]。隨著板栗種植面積不斷擴大，生長期和貯藏期病害種類都有逐年增加的趨勢。在貯藏過程中，板栗怕干、怕水、怕悶、怕熱、怕凍[2]，從而造成貯藏期板栗易失水、霉變、病變等[3]，造成貯藏期板栗果仁腐爛。引起栗果腐爛的病菌如鏈格菌、鐮刀菌、青霉菌[4]等已有報道，發(fā)病初期栗仁上出現(xiàn)各種壞死斑點，嚴重時發(fā)生霉變，有黑斑、褐斑和腐爛三種類型[5]。青霉菌引起的青霉病和種仁斑點病造成腐爛中的濕腐[5]。青霉菌屬廣泛分布于板栗主產區(qū)的腐爛栗實中[6],已報道的有皮落青霉、波蘭青霉、鮮綠青霉、光孢青霉、意大利青霉、指狀青霉、小刺青霉、草酸青霉等[7-8]。本文對引起栗果腐爛的小刺青霉菌的適宜生長條件以及對其敏感藥劑進行了研究，旨在找出控制該病害的有效措施，為板栗產業(yè)健康發(fā)展助力。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株由河北科技師范學院植物保護實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基的配制

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水 1 000 mL、瓊脂粉20 g。

燕麥培養(yǎng)基：燕麥30 g、瓊脂20 g、水 1 000 mL。

板栗培養(yǎng)基：去皮板栗200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g 硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL。

1.3 病菌培養(yǎng)條件篩選

1.3.1培養(yǎng)基對病菌 用5 mm的打孔器在PDA培養(yǎng)基上取菌餅，分別接種到PDA、燕麥、板栗、察氏培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每處理重復3次，7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，12 d后用血球計數(shù)板在顯微鏡下測其產孢量。

1.3.2不同氮源對病菌的影響 將察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉分別用等量酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、氯化銨、硝酸鉀代替，以無硝酸鈉的察氏培養(yǎng)基作為對照，每處理重復3次，測定菌落直徑和產孢量。

1.3.3不同碳源對病菌的影響 將察氏培養(yǎng)基中的蔗糖分別用等量可溶性淀粉、木糖醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇代替，以無蔗糖的察氏培養(yǎng)基作為對照。每處理重復3次，測定菌落直徑和產孢量。

1.3.4不同光照對病菌的影響 用5 mm的打孔器取小刺青霉的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別在25 ℃黑暗，光照/黑暗交替培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復3次，測定菌落直徑和產孢量。

1.3.5不同溫度對病菌的影響 取小刺青霉菌菌餅接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度分別為5、10、15、20、25、30、35 ℃，每處理重復3次，7 d后采用十字交叉法測量其菌落直徑。

1.3.6不同pH對病菌的影響 用NaOH和HCl溶液把PDA培養(yǎng)基的pH分別調至4、5、6、7、8、9、10、11，取小刺青霉菌菌餅接種于平板上，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)， 7 d后采用十字交叉法測量其菌落直徑，每處理重復3次。

1.4 殺菌劑室內毒力測定

1.4.1供試藥劑 24%噻呋酰胺SC(美國陶氏益農公司)、40%氟硅唑EC[興農藥業(yè)(中國)有限公司]、80%多菌靈WP(河北冠龍農化有限公司)、45%咪鮮胺EW(河北冠龍農化有限公司)、25%丙環(huán)唑EC(永農生物科學有限公司)、50%咯菌腈WP[先正達(中國)投資有限公司]

1.4.26種殺菌劑室內毒力測定 采用菌絲生長速率法[9]測定殺菌劑對小刺青霉菌的毒力。每種殺菌劑設置5個梯度，每梯度重復3次。用滅菌的打孔器取直徑5 mm的菌餅分別倒置在含不同藥劑和不同濃度的平板(包含作為對照的不含藥平板)中央，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件培養(yǎng)8 d，采用十字交叉法測量菌落直徑[10]，計算菌絲生長抑制率[12]。然后把菌絲生長抑制率換算成機率值(y)，藥劑濃度轉換以10為底的對數(shù)值，用DPS求出毒力回歸方程y=ax+b，有效抑制中濃度(EC50)及相關系數(shù)[11]。

抑菌率=[(對照菌落直徑(mm)-處理菌落直徑(mm)/對照菌落直徑(mm)-5 mm]×100%

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對小刺青霉菌生長和產孢的影響

小刺青霉菌在4種不同培養(yǎng)基上生長狀態(tài)如表1所示，發(fā)現(xiàn)其在燕麥、板栗、PDA、察氏4種培養(yǎng)基上均能生長，板栗培養(yǎng)基最適宜其生長，7 d菌落直徑達3.72 cm，其次為燕麥培養(yǎng)基，菌落直徑為3.50 cm。PDA培養(yǎng)基與察氏培養(yǎng)基不適宜菌絲生長，7 d菌落直徑僅為2.50 cm左右，但卻最適合其產孢，其產孢量分別為2.40×108和1.70×108cell·L-1。由此可見，板栗培養(yǎng)基適宜該菌的生長，PDA培養(yǎng)基更有利于該菌的產孢。

表1 培養(yǎng)基對小刺青霉菌生長的影響Table 1 Effects of medium on growth of Penicillium spinulosum

2.2 氮源對小刺青霉菌生長和產孢的影響

由表2可知，酵母浸粉為該菌菌絲生長適宜的氮源，培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達3.42 cm,其次是硝酸鈉，菌落直徑為2.87 cm，而供試氮源培養(yǎng)基中以硝酸鉀為培養(yǎng)基的菌絲生長最慢，菌落直徑為1.80 cm。在產孢方面，以酵母浸粉處理產孢最多，為2.93×108cell·L-1，硝酸鉀處理產孢最少，為0.23×108cell·L-1。由此說明，酵母浸粉為氮源有利于菌絲生長和產孢。

表2 氮源對小刺青霉菌生長的影響Table 2 Effects of nitrogen source on growth of Penicillium spinulosum

2.3 碳源對小刺青霉菌生長和產孢的影響

由表3可知，小刺青霉病菌在供試碳源中以可溶性淀粉和木糖醇利用率更高。培養(yǎng)7 d后，菌落直徑分別為3.35和3.28 cm，甘露醇不適宜其菌絲生長，但適宜其產孢，產孢量為1.97×108cell·L-1。

表3 碳源對小刺青霉菌菌絲生長和產孢的影響Table 3 Effects of carbon source on growth of Penicillium spinulosum

2.4 光照對小刺青霉菌生長和產孢的影響

由表4可知，在3種不同培養(yǎng)條件下，小刺青霉病菌均能生長，其中以全黑暗條件下生長最快，菌落直徑達4.35 cm。在全光照和黑暗交替條件下，菌落直徑差異不顯著。3種不同環(huán)境下，該菌的產孢量不存在差異性。說明全黑暗利于該菌菌絲的生長，在任何條件下都能產孢。

表4 光照對小刺青霉病菌生長的影響Table 4 Effects of light on growth of Penicillium spinulosum

2.5 不同溫度、pH對小刺青霉菌生長的影響

由圖1可知，小刺青霉病菌在溫度5～30 ℃條件下均能生長，在15～30 ℃溫度范圍內生長最快，其中以20 ℃為最適生長溫度，菌落直徑為2.90 cm，35 ℃條件下停止生長；小刺青病菌在pH 4～11 PDA培養(yǎng)基上均能生長，其中適宜生長的pH為7，菌落直徑為2.82 cm。

2.6 6種殺菌劑對小刺青霉菌的毒力分析

由表5可知，供試殺菌劑對小刺青霉菌菌絲的生長均有抑制作用。其中以40%氟硅唑抑制效果最好，EC50為0.007 8 mg·L-1；45%咪鮮胺EW和80%多菌靈抑制效果也較好，EC50分別為0.058 8、0.065 0 mg·L-1；而24%噻呋酰胺抑制效果相對較差，EC50為4.732 3 mg·L-1。

注：圖中不同小寫字母分別表示在P< 0.05水平差異具有統(tǒng)計學意義。Note：Different lowcause letters in the figure indicate significant difference at P<0.05 level.圖1 溫度和pH對菌絲生長的影響Fig 1 Effects of temperature and pH on mycelium growth

表5 供試殺菌劑對小刺青霉菌毒力結果Table 5 Test results of virulence test of test fungicide against Penicillium spinulosum

3 討論

青霉菌對植物的危害已引起各界人士廣泛關注。閔曉芳[13]指出產黃青霉和擴展青霉菌絲生長適宜溫度為25 ℃，光照條件對菌絲體生長無差異。杜奕君等[14]指出草酸青霉適宜生長溫度為30 ℃。陶能國等[15]指出指狀青霉和意大利青霉菌絲生長適宜溫度為25 ℃，適宜pH為7。與小刺青霉菌生長環(huán)境略有不同。小刺青霉菌在板栗培養(yǎng)基上生長最快，但產孢量在PDA培養(yǎng)基上最多，生長溫度在5～30 ℃之間，最適溫度為20 ℃；pH為4～11時均能生長，最適pH為7，喜黑暗環(huán)境。不同碳源和氮源對其菌絲的影響，碳源以可溶性淀粉為培養(yǎng)基最適宜菌絲生長，而適宜產孢的碳源為甘露醇；氮源以酵母浸粉為培養(yǎng)基，菌絲生長最快同時產孢最多。

趙建江等[16]明確了氟硅唑與代森錳鋅混配對梨黑星病有較好防效；劉霞等[17]分析了咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對核桃炭疽病菌絲有較強的抑制作用；唐光輝[18]探究出戊唑醇注干殺菌劑對板栗疫病的防治效果最佳。而本文針對小刺青霉病菌進行的室內藥效試驗，結果表明：室內毒力測定的噻呋酰胺、丙環(huán)唑、咪鮮胺、咯菌腈、氟硅唑、多菌靈等幾種殺菌劑中以40%氟硅唑EC對小刺青霉病菌菌絲的抑制效果做好，EC50為0.007 8 mg·L-1；其次為45%咪鮮胺EW和80%多菌靈WP，EC50分別為0.058 8和0.065 0 mg·L-1，24%噻呋酰胺SC抑制效果最差，EC50為4.732 3 mg·L-1。對板栗小刺青霉病菌抑菌效果較好的單劑、復配劑以及生物制劑還有待于進一步研究。