基于傾向性評分匹配法篩選高尿酸血癥的差異核心菌群

紀(jì)澤敏 牟菲 陳姝琴 趙煥虎

中央民族大學(xué)藥學(xué)院，民族醫(yī)藥教育部重點實驗室（中央民族大學(xué)）（北京100081）

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由嘌呤代謝異常引起的代謝性疾病，主要是由于尿酸產(chǎn)生過多或者排泄減少。HUA 患病率與遺傳、性別、年齡、生活方式、飲食習(xí)慣、藥物治療和經(jīng)濟發(fā)展程度等因素顯著相關(guān)，已成為僅次于糖尿病的第二大代謝性疾病[1]。腸道微生物在代謝性疾病中起到關(guān)鍵作用，如痛風(fēng)[2]、糖尿病[3]、肥胖癥[4]等。腸道微生物與代謝性疾病之間的密切關(guān)聯(lián)，為治療HUA 提供了新思路。目前，關(guān)于HUA 病理學(xué)和生理學(xué)機制的研究比較深入，但腸道菌群與HUA 之間作用關(guān)系及其機制的研究較少。本研究對HUA 患者和非HUA 志愿者的腸道菌群進行高通量測序分析，利用傾向性評分匹配法篩選樣本，降低混雜因素對實驗的干擾，分析腸道菌群的物種組成，篩選差異核心菌群并進行功能預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 樣本來源本研究獲得了中央民族大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。受試者來自中央民族大學(xué)校醫(yī)院教職工慢性病體檢和大腸癌篩查項目，均簽署書面知情同意書。受試者均無精神病史，無濫用藥物且1個月內(nèi)無服用過抗生素。

1.2 糞便樣本采集與DNA 提取使用糞便收集器進行糞便采集，每管樣品300 mg，共133個樣品。儲存于-80℃，直至DNA 提取。腸道細菌總DNA提取按照PowerSoil?DNA Isolation Kit 使 用 說明進行操作。

1.3 16 S rDNA 擴增與高通量測序16S rDNA的V3-V4區(qū)PCR擴增的上游引物為308F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），下游引物為806R（5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。反應(yīng)體系（50 μL）為：10 μL buffer，0.2 μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，10 μL High GC Enhancer，10 μmol/L上游引物，10 μmol/L下游引物，1 μL dNTPs，60 ng genomic DNA，ddH2O 補充至總體系50 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，退火時間為30s，退火溫度從95℃到50℃，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共15個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物使用AMPure XP 磁珠純化，目標(biāo)區(qū)域PCR 純化產(chǎn)物進行二次PCR 擴增，最終的PCR 產(chǎn)物進行磁珠純化、Nanodrop 2000定量，瓊脂糖凝膠（1.8%）電泳切膠回收，質(zhì)量合格的文 庫 用Illumina HiSeq 2500（2 × 250 paired ends）進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理測序得到的原始數(shù)據(jù)以FASTQ文件格式儲存。使用Vsearch（vesion 2.8.0）對FASTQ 文件去除引物、去除嵌合體和聚類分析（identity 參數(shù)設(shè)為97%），生成各樣本操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）。每個OTU代表序列比對Silva 參考數(shù)據(jù)庫（Silva 123）[5]得到分類信息。功能預(yù)測分析由QIIME[6]和PICRUSTs[7]共同完成。預(yù)測的功能主要包括Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫中的基因。研究中的繪圖主要在QIIME和R 平臺上完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 25對HUA 組與對照組除尿酸以外的年齡、性別、舒張壓、收縮壓等臨床指標(biāo)進行傾向性評分匹配（propensity score matching，PSM），挑選性別相同的配對樣本分為HUA 組和對照組；運用R edgeR 包篩選差異菌群，P值＜0.05，|log2foldchange| ＞2 則認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。R bnlearn 包用于差異菌群的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推斷，Cytoscape軟件繪制貝葉斯網(wǎng)絡(luò)圖；運用STAMP軟件對組間菌群功能進行差異分析，Welch′s t-test 分析兩組間的差異，P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間臨床信息與傾向性評分匹配共采集133名志愿者的糞便樣品，其中HUA 組有40名，對照組有93名。PSM 前，性別、肌酐、甘油三酯、血尿素氮和尿酸等指標(biāo)在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。成功匹配24對樣本。PSM后，除尿酸（t=-7.805，P ＜0.001）外，其他指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 48例樣本臨床資料統(tǒng)計Tab.1 Clinical information of 48 samples ±s

表1 48例樣本臨床資料統(tǒng)計Tab.1 Clinical information of 48 samples ±s

注：*P ＜0.05；**P ＜0.01

特征描述性別男女年齡（歲）舒張壓（mmHg）收縮壓（mmHg）葡萄糖體質(zhì)量指數(shù)腰臀比谷丙轉(zhuǎn)氨酶膽固醇肌酐高密度脂蛋白甘油三酯低密度脂蛋白血尿素氮尿酸同型半胱氨酸對照組3 21 69.79±8.62 78.67±10.3 131.42±16.82 5.9±1.17 25.57±3.4 0.86±0.07 26.5±17.67 5.22±1.09 68.63±13.98 1.4±0.29 2.18±1.27 3.29±0.88 5.15±1.28 293.67±50.38 13.14±3.23高尿酸血癥組3 21 70.88±9.84 78.46±10.54 140.38±18.2 6.3±1.22 25.2±2.59 0.86±0.07 22.42±9.8 5.15±1.26 74.5±16.6 1.4±0.35 1.92±0.84 3.23±0.99 5.8±1.45 416.38±58.26 14.23±4.82統(tǒng)計量χ2 =0 t=-0.406 t=0.069 t=-1.771 t=-1.166 t=0.427 t=0.348 t=0.99 t=0.205 t=-1.326 t=0.009 t=0.835 t=0.224 t=-1.631 t=-7.805 t=-0.923 P 值1 0.687 0.945 0.083 0.25 0.671 0.729 0.327 0.838 0.191 0.993 0.408 0.823 0.11 0.000** 0.361

2.2 測序數(shù)據(jù)與評估經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，共獲得6 540 093條reads，平均每個樣本含有136 251.938條reads。Chao1及shannon多樣性稀釋曲線（圖1）表明各個樣本的測序數(shù)據(jù)深度都已足夠，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

圖1 Chao1及shannon多樣性稀釋曲線Fig.1 Chao1 diversity index curves and Shannon diversity index curves for the sequenced sample

2.3 腸道菌群的物種組成分析本研究分別從門、綱、目、科、屬水平上對菌群進行鑒定和分析，共鑒定24個門，319個屬。門水平上（圖2A），HUA組中Proteobacteria（13.6%vs.10.5%）、Actinobacteria（6.2%vs.3.5%）高于對照組，F(xiàn)irmicutes（50.5%vs.54.5%）、Bacteroidetes（28.4%vs.30.9%）低于對照組。屬水平上（圖2B），平均相對豐度＞2%的優(yōu)勢屬中，HUA 組中的Bacteroides（25.5%vs.19.7%）、Escherichia/Shigella（8.9%vs.5.6%）、Clostridium Xl-Va（5.9%vs.1.4%）、Bifidobacterium（4.9%vs.2.5%）、Megasphaera（2.6%vs.1.1%）、Gemmiger（2.3%vs.1.6%）含量高于對照組，F(xiàn)aecalibacterium（8.8%vs.8.9% ）、Lachnospiracea_incertae_sedis（5.8%vs.8.1%）、Roseburia（5.7%vs.7.4%）、Prevotella（0.5%vs.7.8%）、Klebsiella（1.8%vs.2.9%）、Blautia（1.7%vs.2.2%）低于對照組。

2.4 菌群多樣性分析α多樣性分析顯示，HUA組的物種多樣性低于對照組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（chao1指數(shù)：P=0.2，Shannon指數(shù)：P=0.16）（圖3A-B）?；赨nweighted Unifrac 距離和Weighted Unifrac距離的主成分坐標(biāo)分析（圖3C-D）未發(fā)現(xiàn)明顯的聚類。adonis檢驗顯示，無論基于哪種算法，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Unweighted Unifrac：R2= 0.02，P=0.52；Weighted Unifrac：R2=0.01，P=0.89）。

2.5 高尿酸血癥的差異核心菌群分析雖然α和β多樣性分析顯示HUA 組和對照組樣本腸道菌群的主要構(gòu)成沒有明顯差異，但在屬水平上的差異分析，找到23個差異OTU（圖4A）。根據(jù)物種注釋信息，組間差異菌群共有19個，在對照組高表達的有13個，分別為Coprococcus、Barnesiella、Clostridium IV、Anaerostipes、Dialister、Lachnospiracea_incertae_sedis、Eubacterium、Veillonella、Bacteroides、Rose-buria、Haemophilus、Alistipes和Klebsiella，在HUA 組高表達的有6個，分別是Flavonifractor、Acetanaerobacterium、Anaerovorax、Bilophila、Acidaminobacter、Anaerotruncus。

圖2 組間菌群門（A）、屬（B）水平相對豐度柱狀圖Fig.2 Bar plots of the relative abundances of gut microbiota at phylum（A）and genus（B）level

差異OTU的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖4B）顯示，與是否患有HUA 直接相關(guān)的是差異核心菌群是Flavonifractor（OTU_2403）、Acidaminobacter（OTU_2409）、Bilophila（OTU_6）。

2.6 高尿酸血癥患者與對照組腸道菌群功能比較對差異核心菌群進行功能預(yù)測分析，在KO2水平上共鑒定到37個KEGG 通路，其中Signal Transductiona 通路在HUA 組高于對照組，差異并有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021）。在KO3水平上共鑒定到200個KEGG 通路，HUA 患者腸道菌群中雙組分系

圖3 組間多樣性指數(shù)比較Fig.3 Comparison of α-diversity indexes[chao1（A）；shannon（B）]and β-diversity indexes[Unweighted Unifrac distance（C）；Weighted Unifrac distance（D）]between two groups

圖4 差異分析可視化火山圖和差異菌群貝葉斯網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Volcano plot（A）and Bayesian network（B）of differential gut microbiota

注：A，α多樣性分析（chao1 指數(shù)）；B，α多樣性分析（Shannon 指數(shù)）；C，β多樣性分析（Unweighted Unifrac 距離）；D，β多樣性分析（Weighted Unifrac 距離）統(tǒng)（Two-component system）（P= 0.020）、光合生物中的碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）（P= 0.025）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）（P= 0.028）、果糖和甘露糖代謝（Fructose and mannose metabolism）（P=0.042）等通路高于對照組，差異并有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

圖5 組間功能預(yù)測比較分析Fig.5 Comparison of functional predictions between two groups

3 討論

高尿酸血癥是一種復(fù)雜的代謝性疾病，與痛風(fēng)、高血壓、糖尿病、腎病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-10]，其對老年人的危害是不可忽視的問題。人體胃腸道定植了數(shù)萬億個微生物，腸道微生物失調(diào)與許多代謝性疾病有關(guān)[11]。為了探索腸道菌群與HUA 之間的相關(guān)性，本研究對HUA 患者和非HUA 人群的腸道菌群進行差異分析及功能預(yù)測。

腸道菌群的差異分析和貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推斷分析結(jié)果顯示，F(xiàn)lavonifractor、Acidaminobacter、Bilophila含量與HUA的直接相關(guān)且在HUA 組中含量較高。研究發(fā)現(xiàn)，Bilophila Wadsworthia與伴有Oddi 松弛括約肌的膽管結(jié)石病、肥胖、早期小兒多發(fā)性硬化癥[12-14]有關(guān)。B. wadsworthia能引起SPF 小鼠的全身炎癥反應(yīng)[15]，與高脂肪飲食協(xié)同作用可以促進更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)、腸屏障功能障礙、膽汁酸代謝障礙以及更嚴(yán)重的葡萄糖代謝障礙[16]。其中，腸屏障功能障礙能增加腸道對細菌內(nèi)毒素（如LPS）的滲透性，并反過來增加粘膜炎癥并導(dǎo)致全身性炎癥。Flavonifractor是屬于梭菌屬（Clostridiales）的厭氧革蘭陽性桿菌。Flavonifractor的富集與自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡有關(guān)[17]。Flavonifractor plautii也可能是膽囊炎[18]和小兒炎性腸病的潛在病原體[19]。體外實驗證實，與IgG 高度結(jié)合的F. plautii和人體細胞培養(yǎng)物接觸時能表現(xiàn)出侵襲能力并誘導(dǎo)促炎性免疫應(yīng)答[19]。痛風(fēng)的急性癥狀由對尿酸單鈉結(jié)晶的炎癥反應(yīng)引發(fā)，主要由巨噬細胞和中性粒細胞介導(dǎo)，先天免疫途徑在痛風(fēng)的發(fā)病機制中是至關(guān)重要的，并且飲食會影響高尿酸血癥以及痛風(fēng)中巨噬細胞的炎癥狀態(tài)[19]。Flavonifractor對HUA的影響可能與機體免疫或促進炎癥的發(fā)生有關(guān)。Acidaminobacter是蛋白質(zhì)發(fā)酵菌屬，發(fā)酵氨基酸特別是谷氨酸，乙酸是主要的代謝產(chǎn)物。目前Acidaminobacter與疾病相關(guān)性尚未見研究報道。

功能預(yù)測結(jié)果顯示，雙組分系統(tǒng)在HUA 組中上調(diào)，雙組分系統(tǒng)通常使細胞能夠通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的變化來感知和響應(yīng)刺激。糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝屬于碳水化合物代謝途徑，光合生物中的碳固定屬于能量代謝途徑，其在HUA 組均上調(diào)，這與YU[20]等的研究發(fā)現(xiàn)在碳水化合物和能量代謝途徑在高尿酸血癥小鼠中上調(diào)的結(jié)果一致。

本研究分析高尿酸血癥患者與非高尿酸血癥人群的腸道差異菌群，發(fā)現(xiàn)Flavonifractor、Acidaminobacter、Bilophila與HUA 緊密相關(guān)，其豐度變化在高尿酸血癥的發(fā)生和發(fā)展過程中可能有重要作用。本研究中篩選出的菌屬對高尿酸血癥的影響還需要進一步的實驗進行驗證。綜上所述，本研究為后續(xù)基于腸道菌群的高尿酸血癥研究提供參考。