氨肽酶P2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

曾瑤 徐惠麗 王夢漪 張子龍

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科（武漢430014）；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院（荊州434020）

結(jié)直腸癌作為一種常見的消化道惡性腫瘤[1-3]，在我國的發(fā)病率和死亡率均高居所有惡性腫瘤的第5位，嚴(yán)重威脅國民的生命健康[4-5]。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的多步驟復(fù)雜過程，其中，原癌基因的激活和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)扮演著重要的角色[6-10]。XPNPEP2（也稱為氨肽酶P2 或APP2）作為一種膜結(jié)合金屬蛋白酶，由位于Xq25 染色體上的人XPNPEP2 基因編碼，可催化去除氨基酸序列中脯氨酸N 端P1位點(diǎn)的氨基酸殘基，如Arg-Pro-Pro 等[11-14]。既往關(guān)于XPNPEP2生物學(xué)功能的研究主要集中在心血管疾病方面，其可參與血管舒張劑緩激肽的代謝過程[13]及ACEI 藥物引起的血管性水腫[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究表明，XPNPEP2在宮頸癌[15]、前列腺癌[16]及胃癌[17]中異常表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后密切相關(guān)[15，17]。然而，關(guān)于XPNPEP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其臨床預(yù)后價值尚未見報道。在前期，我們通過GEPIA在線數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，因此推測XPNPEP2的表達(dá)異常可能也參與了結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展?；诖耍狙芯繑M利用免疫組織化學(xué)方法對113例結(jié)直腸癌組織及配對癌旁組織中XPNPEP2蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并分析其表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以探究其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇于2014年1月至2015年6月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院接受手術(shù)治療、并符合下述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的113例結(jié)直腸癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理學(xué)明確診斷為結(jié)直腸癌；術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療；接受規(guī)范性的結(jié)直腸癌根治手術(shù)；患者臨床病理信息和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)為：術(shù)前已轉(zhuǎn)移、接受姑息性切除的患者；排除5年內(nèi)有其他惡性腫瘤既往史者。術(shù)后病理分期采用國際抗癌協(xié)會（UICC）第7 版腫瘤分期系統(tǒng)。結(jié)直腸癌及對應(yīng)癌旁組織樣本經(jīng)手術(shù)切除后迅速進(jìn)行多點(diǎn)取材，經(jīng)4%甲醛溶液固定并石蠟包埋保存?zhèn)溆?。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院和附屬荊州醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，知情同意書已于標(biāo)本收集時簽署。

1.2 免疫組化染色組織石蠟標(biāo)本制作成4 μm切片，免疫組化染色按試劑盒說明書進(jìn)行。主要步驟包括：石蠟切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟，再置于二甲苯中脫蠟2次，酒精梯度水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷和山羊血清室溫封閉后，加入兔抗人XPNPEP2 一抗（1∶200，美國Abcam公司）4℃孵育過夜；次日滴加標(biāo)記有HRP的二抗（山羊抗兔二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司），室溫孵育30 min，顯色劑（DAB）顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間。蘇木精行細(xì)胞核復(fù)染，乙醇水化及二甲苯透明，中性樹膠封片，在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行閱片和結(jié)果判定。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果評分采用雙盲法由2名具有豐富經(jīng)驗的實驗員對免疫組化結(jié)果進(jìn)行閱片并評分。XPNPEP2 陽性結(jié)果為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色至深褐色。結(jié)果判定分別根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行。染色強(qiáng)度：0 分（陰性），1 分（弱陽性，淺黃色），2 分（中等陽性，棕黃色），3 分（強(qiáng)陽性，褐色）；陽性細(xì)胞百分比：0 分（≤5%），1 分（6%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4 分（≥76%）。兩項評分的乘積為最終的評分，總分范圍0～12 分，≤6 分定義為低表達(dá)，＞6 分定義為高表達(dá)。

1.4 臨床資料收集及隨訪通過查閱患者病歷檔案，收集患者臨床病理信息，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤及TNM 分期等。采用電話隨訪或門診復(fù)診等方式自手術(shù)當(dāng)日起進(jìn)行隨訪，隨訪截止時間為2018年12月31日，隨訪時間42～60個月，中位隨訪時間52個月。記錄患者的無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）和總生存期（overall survival，OS）。RFS：確診之日至局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或最后1次隨訪日期；OS：確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier 生存函數(shù)計算無復(fù)發(fā)生存率及總生存率并繪制生存曲線，組間生存差異比較采用Log-rank檢驗。采用單因素分析探究影響無復(fù)發(fā)生存率和總生存率的危險因素，有顯著意義的風(fēng)險因子（P＜0.05）納入Cox 比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，探究影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 XPNPEP2蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平如圖1A 所示，XPNPEP2表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中均有表達(dá)，在癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度高于癌旁組織。免疫組化評分顯示，XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)評分顯著高于癌旁組織（t= 17.02，P＜0.001），見圖1B。進(jìn)一步根據(jù)腫瘤的TNM 分期分層分析顯示，XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平隨著分期升高而升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1C。

圖1 XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of XPNPEP in colorectal cancer and adjacent normal tissues

2.2 XPNPEP2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系根據(jù)上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，XPNPEP2在69例結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，高表達(dá)率為61.06%（69/113）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中XPNPEP2 高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、脈管浸潤及TNM 分期顯著相關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

2.3 XPNPEP2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系在113例結(jié)直腸癌患者中，XPNPEP2 高表達(dá)患者69例，無復(fù)發(fā)生存率為50.7%，總生存率40.6%；低表達(dá)患者44例，無復(fù)發(fā)生存率為72.7%，總生存率70.5%。Kaplan-Meier 生存分析顯示，XPNPEP2蛋白高表達(dá)組患者的無復(fù)發(fā)生存率和總生存率均顯著低于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 8.531，P= 0.003；χ2= 11.751，P= 0.001），見圖2A和2B。

單因素分析顯示，腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、TNM 分期及XPNPEP2表達(dá)水平是影響結(jié)直腸癌患者無復(fù)發(fā)生存率和總生存率的危險因素（均P＜0.05），見表2；將單因素分析中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的指標(biāo)納入多因素Cox比例風(fēng)險模型多因素分析表明，TNM 分期及XPNPEP2表達(dá)水平是影響患者無復(fù)發(fā)生存率（HR：2.99，95%CI：1.49～8.16，P= 0.003；HR：1.66，95%CI：1.19～2.96，P= 0.015）和總生存率（HR：5.01，95%CI：1.49～16.82，P= 0.009；HR：1.75，95%CI：1.24～3.57，P=0.023）的獨(dú)立危險因素，見表3。

3 討論

XPNPEP2蛋白作為一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的氨基酰基脯氨酸水解酶，由XPNPEP2 基因編碼，主要表達(dá)于人體的腎、肝和肺的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面[11]。在既往的研究中，主要關(guān)注了XPNPEP2在心血管疾病中的功能[13-14]，很少探討關(guān)其在惡性腫瘤中的作用。到目前為止，僅局限于宮頸癌、前列腺癌和胃癌中，但扮演的角色卻不盡相同[15-17]。在本研究中，我們通過分析113例結(jié)直腸癌組織中XPNPEP2蛋白的表達(dá)水平及其與患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的相關(guān)性，證實了XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、脈管浸潤、TNM 分期及患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。進(jìn)一步的單因素和多因素分析提示，XPNPEP2 高表達(dá)是影響患者無復(fù)發(fā)生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。上述研究結(jié)果表明，XPNPEP2在結(jié)直腸癌中扮演著促癌基因的角色，這與其在胃癌和宮頸癌中的作用相似[15，17]。

表1 XPNPEP2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between XPNPEP2 expression and clinicopathological characteristics in colorectal cancer

表2 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表3 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

目前，關(guān)于XPNPEP2 影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，研究仍較為有限。CHENG 等[15]首先報道了XPNPEP2在宮頸癌中的表達(dá)及功能，研究者通過一系列體外、體內(nèi)實驗結(jié)合臨床樣本分析，發(fā)現(xiàn)XPNPEP2在宮頸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更晚的FIGO 分期有關(guān)，生存分析表明XPNPEP2 高表達(dá)患者的總生存期顯著縮短。進(jìn)一步的機(jī)制研究證實，XPNPEP2可通過誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程，增強(qiáng)其侵襲和遷移能力，進(jìn)而介導(dǎo)宮頸癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移。最近，LI 等[16]通過高密度多器官腫瘤組織陣列芯片分析XPNPEP2在人體腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)譜，結(jié)果顯示XPNPEP2在正常前列腺組織中適度表達(dá)，而在前列腺癌中顯著降低；進(jìn)一步，研究者使用TCGA數(shù)據(jù)庫，IHC和ELISA驗證了XPNPEP2在前列腺癌患者組織和血清中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)XPNPEP2在前列腺癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常前列腺組織，但在局部晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織中的表達(dá)水平較早期前列腺癌更高，聯(lián)合使用PSA和XPNPEP2可提高對患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測準(zhǔn)確性。王偉等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，其高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、脈管浸潤及TNM 分期均無明顯相關(guān)性；生存分析表明XPNPEP2 高表達(dá)的胃癌患者生存率顯著低于低表達(dá)者，而COX多因素分析顯示XPNPEP2 不是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。上述研究結(jié)果提示，XPNPEP2在惡性腫瘤中的表達(dá)和作用可能具有癌種特異性，不同腫瘤中XPNPEP2的表達(dá)水平、臨床意義及分子功能不盡相同。

本研究通過臨床樣本檢測分析，首次證實了XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與多種不良臨床病理學(xué)特征及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，本研究僅局限于臨床樣本分析，未在細(xì)胞及動物水平對XPNPEP2 介導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探索和驗證；同時，本研究納入的臨床樣本來源于兩中心，且數(shù)量僅為113例，可能使得某些分析結(jié)果出現(xiàn)偏移。盡管如此，本研究的結(jié)果為進(jìn)一步探究XPNPEP2在結(jié)直腸癌中的分子功能及潛在機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。在未來，我們一方面將收集更多臨床樣本對本研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證；同時也將開展體外及體內(nèi)實驗，對XPNPEP2 促進(jìn)結(jié)直腸癌的潛在分子機(jī)制進(jìn)行探究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明XPNPEP2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其高表達(dá)與多種不良臨床病理特征及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。