孕酮調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)及預(yù)后的實(shí)驗(yàn)研究

陳曉晨， 任雪嬌， 高偉偉， 岳樹源*

顱腦創(chuàng)傷（traumatic Brain injury，TBI）后的局部免疫炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是繼發(fā)性腦損傷病理過程中最為重要的影響因素之一［1］。免疫炎性細(xì)胞因子的效應(yīng)具有雙重性，在腦損傷發(fā)生后早期，主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用，而在隨后的過程中則可以誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)和組織重建。早期對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制可以減輕腦水腫，減少神經(jīng)元的死亡或膠質(zhì)增生。孕酮目前被證實(shí)具有抗炎［2］，抗水腫，抗氧化，抗凋亡，修復(fù)DNA，抑制興奮性遞質(zhì)，促進(jìn)神經(jīng)髓鞘修復(fù)，促進(jìn)腦組織分泌腦營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子等多種促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)與再生的功能［3?5］。部分臨床實(shí)驗(yàn)還證實(shí)在TBI早期應(yīng)用孕酮可獲得更好的預(yù)后，但孕酮治療TBI的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。越來越多的證據(jù)表明，免疫炎癥反應(yīng)是腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)損傷的關(guān)鍵一環(huán)。因此本實(shí)驗(yàn)擬建立小鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型［6］，利用mNSS評(píng)分［7］、干濕重法、Western blot、免疫組織化學(xué)染色法及流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)孕酮對(duì)神經(jīng)功能、腦水腫、炎性因子、炎性細(xì)胞表達(dá)及免疫細(xì)胞的影響，初步探索孕酮在腦創(chuàng)傷后的免疫炎癥調(diào)節(jié)作用及神經(jīng)保護(hù)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

雄性C57BL/6小鼠（華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)scxk（京）2014?0004，中國北京），體重20～22 g，自由進(jìn)食飲水，室溫（25.0±0.5）℃，分籠喂養(yǎng)，自然光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將360只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，孕酮治療組和對(duì)照組。每組按處理方式不同分為5個(gè)亞組，分別在處理后第1、3、5、7天行mNSS評(píng)分檢測(cè)、干濕重測(cè)腦組織水含量、Western blot、免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemical staining，IHC）及脾流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，即每個(gè)亞組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只（n=6）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TBI模型的制備 小鼠麻醉后，將其頭部固定于立體定向儀。選取中線右側(cè)旁開1 mm，人字縫以上1 mm處，開顱，暴露腦皮質(zhì)，使用控制性腦皮質(zhì)撞擊儀（Custom Design&Fabrication公司，美國）設(shè)置打擊深度1.33 mm，打擊速度4.5 m/s，進(jìn)行打擊，縫合頭皮。假手術(shù)組僅不對(duì)腦皮質(zhì)打擊，其余處理與另外兩組相同。孕酮治療組打擊后1小時(shí)腹腔內(nèi)注射孕酮（16 mg/kg），隨后每天同一時(shí)間注射相同劑量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組在相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能檢測(cè) 分別在處理后第1、3、5、7天根據(jù)mNSS評(píng)分表，從運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射四方面對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)測(cè)，總分為0～18分，分?jǐn)?shù)越高，說明動(dòng)物的神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.3.3 腦組織含水量測(cè)定 在造模后第1、3、5、7天對(duì)各組小鼠進(jìn)行斷頭處理，使用精密電子分析天平（METLLER TOLEDO公司，瑞士）測(cè)其濕重。然后置于100℃烤箱烘烤24 h，稱干重。分別計(jì)算各組小鼠腦組織水含量，公式為：腦含水量（%）=（濕重?干重）/濕重×100%。

1.3.4 蛋白印跡法（Western Blot） 取各組處理后第1、3天小鼠損傷同側(cè)腦組織，加入適量PMSF、裂解液，裂解30min；用BCA法測(cè)定其蛋白濃度，取等量蛋白于SDS?PAGE中電泳分離；電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜（PVDF膜）上，分別孵育以下一抗：兔抗人TNF?α（1∶10 000），兔抗小鼠 NF?κB（1∶500），小鼠抗人 IL?1β（1∶1000），大鼠抗人 IL?10（1∶1000）（abcam公司，英國），4℃過夜。孵育相應(yīng)二抗（1∶5 000）（中杉金橋公司，北京），經(jīng)曝光液處理，使用凝膠成像儀進(jìn)行曝光。通過Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，比對(duì)灰度值，統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色 取腦組織切片，經(jīng)酒精和二甲苯脫蠟處理，檸檬酸鈉液對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，常溫3%BSA封閉1 h后，分別加入相應(yīng)一抗：兔抗人CD3，GFAP，Iba?1，MPO，4度過夜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h。PBS洗滌后，在辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗室溫下孵育，PBS洗滌后，進(jìn)行DAB顯色，蘇木復(fù)染，進(jìn)行脫水處理，封片。光鏡下觀察照相。在各組小鼠相同皮質(zhì)部位，隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例取各組處理后第1、3天小鼠脾臟。研磨，加入紅細(xì)胞裂解液（索萊寶科技有限公司，北京）。離心后棄去上清，設(shè)置單陽及空白對(duì)照，其余樣品加入相應(yīng)抗體：CD4＋、CD25＋、CD4＋和CD25+雙陽性、Foxp3，避光孵育，離心棄去上清，加入破膜液，4℃下避光孵育。離心棄去上清，除空白和單陽外，均加入Foxp3，4度下避光孵育，離心棄去上清，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過濾處理后上機(jī)。

1.4 分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕酮對(duì)大鼠腦損傷后神經(jīng)功能的影響

分別在處理后1、3、5、7天3組小鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分。處理后第1天，腦創(chuàng)傷組小鼠mNSS評(píng)分無顯著性差異，均高于假手術(shù)組；孕酮治療組小鼠mNSS評(píng)分在腦創(chuàng)傷后第3、5、7天時(shí)明顯低于創(chuàng)傷對(duì)照組（P＜0.05），二者均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）（表1）。傷后第1天，孕酮治療組和對(duì)照組小鼠mNSS評(píng)分無顯著性差異，均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；隨后第3、5、7天，孕酮治療組小鼠mNSS評(píng)分明顯低于對(duì)照組，但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

表1 三組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分

2.2 孕酮對(duì)腦損傷后腦水腫的影響

同創(chuàng)傷對(duì)照組相比，孕酮治療組小鼠的腦組織水含量在傷后第 1、3、5、7天明顯減輕（P＜0.05）；二者腦組織水含量均較假手術(shù)組明顯增高（P＜0.05）。如表2所示，孕酮治療組小鼠腦組織含水量在傷后第1、3、5、7天明顯減輕，與假手術(shù)組比較無顯著性差異；而同創(chuàng)傷對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 三組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織水含量（%）

2.3 孕酮對(duì)腦損傷后炎癥因子表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，傷后第1、3天，創(chuàng)傷組炎性因子（IL?1β、TNF?α、NF?κB、IL?10）表達(dá)和炎性細(xì)胞（CD3、GFAP、Iba?1、MPO）數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；與創(chuàng)傷對(duì)照組相比，孕酮治療組炎性因子表達(dá)和炎性細(xì)胞數(shù)量明顯下降（P＜0.05），見圖1。

2.4 孕酮對(duì)腦損傷后腦損傷灶炎性細(xì)胞數(shù)量的影響

處理后第1、3天，同假手術(shù)組相比，腦創(chuàng)傷組小鼠腦損傷灶中GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞）及Iba?1（小膠質(zhì)細(xì)胞）陽性膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05）；同創(chuàng)傷對(duì)照組相比，孕酮能明顯減少腦損傷灶處GFAP及 Iba?1細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）。MPO（中性粒細(xì)胞）及CD3（T細(xì)胞）細(xì)胞在處理后第1天表現(xiàn)出明顯差異，創(chuàng)傷組較假手術(shù)組細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05），同創(chuàng)傷對(duì)照組相比，孕酮能明顯減少腦損傷灶處MPO及CD3細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）；處理后第3天統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，MPO及CD3細(xì)胞數(shù)量在孕酮治療組及假手術(shù)組無明顯差異，二者較創(chuàng)傷對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05），見圖2。

2.5 孕酮對(duì)外周Treg數(shù)量的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例。TBI后，小鼠脾臟中Treg有下降趨勢(shì)。同創(chuàng)傷對(duì)照組相比，孕酮治療組顯著減輕脾臟內(nèi)Treg減少水平，但仍未達(dá)到假手術(shù)組水平，各組小鼠脾臟內(nèi)Treg數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

3 討論

目前越來越多證據(jù)表明，免疫炎癥反應(yīng)是腦損傷后繼發(fā)性神經(jīng)損傷的關(guān)鍵一環(huán)［8，9］。已經(jīng)明確，腦損傷后，腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)的迅速激活，多種細(xì)胞因子（IL?1β、TNF?α、IL?12等）數(shù)量的上調(diào)等，這些免疫系統(tǒng)的變化，促進(jìn)了神經(jīng)元的凋亡，壞死，破壞血腦屏障，加重了神經(jīng)功能的損傷［10］。本次實(shí)驗(yàn)以創(chuàng)傷性腦損傷模型小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，證實(shí)孕酮可以調(diào)節(jié)小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后免疫炎癥反應(yīng)及改善其預(yù)后，并初步發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制同Treg的關(guān)聯(lián)性。

本次實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠TBI后引起腦組織炎癥反應(yīng)，腦損傷灶處大量炎性細(xì)胞聚集，同假手術(shù)組相比，創(chuàng)傷組炎性因子含量及炎性細(xì)胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.055）；但同創(chuàng)傷對(duì)照組相比，孕酮治療組小鼠腦損傷灶炎癥反應(yīng)明顯減輕。而對(duì)炎癥細(xì)胞的抑制可以減輕腦水腫和腦損傷［11］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)孕酮治療后，腦創(chuàng)傷后小鼠腦組織水腫減輕，其神經(jīng)功能改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。近年新發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)能力的T淋巴細(xì)胞，它能夠調(diào)控多系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，緩解組織損傷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來越證實(shí)Treg具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，如在腦缺血的研究中已經(jīng)部分證實(shí)Treg具有免疫調(diào)節(jié)能力和調(diào)控炎癥反應(yīng)的功能，促進(jìn)缺血性腦損傷時(shí)神經(jīng)功能的恢復(fù)［12，13］。本實(shí)驗(yàn)從調(diào)節(jié)性T細(xì)胞入手，發(fā)現(xiàn)孕酮在創(chuàng)傷性腦損傷后發(fā)揮作用機(jī)制同T細(xì)胞的相關(guān)關(guān)系。顱腦創(chuàng)傷后，注射孕酮使腦組織內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而炎性細(xì)胞及炎性因子的數(shù)量明顯減低，由此可以推測(cè)出，孕酮可能通過上調(diào)Treg數(shù)量來間接減少炎性因子及炎性細(xì)胞的數(shù)量，減少腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)，減輕腦水腫，改善預(yù)后。

核轉(zhuǎn)錄因子（NF?κB）在顱腦損傷后活性明顯升高，是炎癥反應(yīng)進(jìn)程中的上游調(diào)控因子，可促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，如IL?1β，TNF?α，C3和GFAP等，在炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用，且NF?kB是調(diào)節(jié)Treg的關(guān)鍵信號(hào)，是產(chǎn)生活性 Treg的必須因子［14，15］。多種細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor?a）TNF等都受到孕酮與Treg的調(diào)控。Treg可分泌和表達(dá)IL?10等抑炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而作用于效應(yīng)性T細(xì)胞，緩解炎癥反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用脾流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，比較了各組腦損傷后脾臟內(nèi)Treg的數(shù)量變化，結(jié)果顯示孕酮顯著增加了腦損傷后脾臟內(nèi)Treg數(shù)量，同損傷對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？沙醪綌喽ㄔ型谀X損傷后的抗炎癥作用同Treg之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，即孕酮可能通過調(diào)控了Treg的水平來實(shí)現(xiàn)的。即使二者之間沒有直接調(diào)節(jié)關(guān)系，由于Treg具有抑制炎性反應(yīng)的功能，在孕酮治療TBI同時(shí)人工促進(jìn)Treg在腦損傷區(qū)的歸巢，有望增強(qiáng)孕酮治療TBI的療效。通過本次實(shí)驗(yàn)們了解到，孕酮和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及炎性反應(yīng)存在某種間接的聯(lián)系，下一步我們將著重研究證實(shí)孕酮與T細(xì)胞及炎性因子的調(diào)控機(jī)制。

本次實(shí)驗(yàn)通過創(chuàng)建創(chuàng)傷模型，設(shè)立對(duì)照及空白對(duì)照組，比較了孕酮治療小鼠預(yù)后評(píng)分，腦組織內(nèi)炎性細(xì)胞及因子表達(dá)情況，間接推測(cè)出運(yùn)動(dòng)對(duì)于顱腦創(chuàng)傷具有保護(hù)作用，可能是通過調(diào)控Treg細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。但本次實(shí)驗(yàn)仍有一定不足，例如樣本數(shù)量仍較小，對(duì)于mNSS評(píng)分、腦組織含水量以及細(xì)胞計(jì)數(shù)存在一定主觀性等。綜上，可以證實(shí)孕酮調(diào)節(jié)了創(chuàng)傷后局部的免疫炎癥反應(yīng)，改善了腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能的預(yù)后。但孕酮在創(chuàng)傷性腦損傷后的具體作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。