靈菌紅素通過(guò)促進(jìn)Bim調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞凋亡

葉惠榮， 吳麗華， 張玉娟， 高學(xué)忠， 王西躍， 曹茵

［關(guān)健詞］ 人乳腺癌MCF?7細(xì)胞；靈菌紅素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，是女性第二大惡性腫瘤，發(fā)病年齡日趨年輕化，嚴(yán)重威脅女性身心健康［1］。約15%～20%的乳腺癌患者會(huì)發(fā)生骨、肺和腦轉(zhuǎn)移，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的5年生存率僅為20%［2］。研究與開(kāi)創(chuàng)各類治療乳腺癌的藥物和方法具有十分重要的意義。

靈菌紅素（prodigiosin，PG）是一類天然紅色素家族的總稱，由多種放線菌和細(xì)菌屬產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，PG的生物學(xué)活性主要包括免疫抑制、抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾等［3］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PG在治療腫瘤方面具有重大潛力，美國(guó)癌癥研究所Melvin等［4］研究發(fā)現(xiàn)PG濃度為2.1 μmol/L時(shí)對(duì)57中不同腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性、對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)明顯毒副作用，提示PG對(duì)腫瘤細(xì)胞作用具有靶向性。既往研究顯示PG能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞［5］、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞［6］、口腔鱗癌細(xì)胞［7］、急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞［8］等。然而尚不清楚其對(duì)乳腺癌MCF?7細(xì)胞的凋亡調(diào)控作用和機(jī)制，因此本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討PG調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 人乳腺癌細(xì)胞獲取

人乳腺癌細(xì)胞系MCF?7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生命化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑耗材

靈菌紅素Prodigiosin（CAS號(hào) 56144?17?3，Sig?ma公司），MEM培養(yǎng)基（Gibco公司），Bim抗體（#2933，CST公司），β?Tubulin Antibody抗體（#2146，CST公司），CCK8試劑盒（Catalog no.C0009，碧云天公司），TUNNEL試劑盒（Catalog no.12 156 792 910；Roche公司），慢病毒LV?sh Bim購(gòu)自百恩維生物。

1.3 細(xì)胞處理

培養(yǎng)MCF?7細(xì)胞，使用不同濃度PG培養(yǎng)液處理（0、1、2、4、8、16 μg/mL），于24、48、及72小時(shí)收集細(xì)胞，MTT檢測(cè)細(xì)胞增值率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。RT?PCR及Western Blot檢測(cè)Bim（Bcl?2?interacting mediator of cell death）表達(dá)情況。為了進(jìn)一步明確靈菌紅素通過(guò)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡，構(gòu)建Bim siRNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)MCF?7細(xì)胞中Bim表達(dá)情況以確保沉默效率；檢測(cè)MCF?7細(xì)胞中Bim沉默后，PG對(duì)MCF?7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)情況。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF?7細(xì)胞，重懸浮后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪于96孔板中。24小時(shí)后分別加入不同濃度的PG培養(yǎng)液處理（0、1、2、4、8、16 μg/mL），每個(gè)濃度組平行4孔。PG處理24、48、及72 h后每孔加入MTT 100 μL，置于培養(yǎng)箱中4 h。棄上清、加入DMSO 100 μL，避光震蕩10 min后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。細(xì)胞存活率=測(cè)試組OD平均值/對(duì)照組OD平均值×100%。

1.5 TUNEL實(shí)驗(yàn)

消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，依據(jù)說(shuō)明書(shū)將MCF?7細(xì)胞1×105/mL加入96孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液并無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，配置TUNEL孵育液并加入MCF?7細(xì)胞中孵育1 h，棄去TUNEL并PBS清洗一遍，加入DAPI（1 μg/mL）避光孵育15 min，加入抗熒光淬滅液，最后熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.6 流式細(xì)胞（FCM）實(shí)驗(yàn)

依據(jù)說(shuō)明書(shū)將MCF?7細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液、PBS清洗、胰酶消化、血清終止，離心后重懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105～1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液至流式細(xì)胞管中，加入Annexin V?FITC 5 μL和10 mg/L碘化丙啶（PI）10 μL，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/M細(xì)胞數(shù)）/（G0/G1+S+G2/M細(xì)胞數(shù)）×100%；凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.7 RNA提取和Real?time RT?PCR

收集處理好的各組細(xì)胞、PBS洗滌后提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。羅氏Light?Cycler PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性 5 s，60℃退火34 s，40次循環(huán)后，95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃再變性 15 s，GAP?DH 作為內(nèi)參。引物序列為：GAPDH?F：5′?CCA GAA CAT CAT CCC TGC CTC TAC T?3′，GAPDH?R：5′?GGT TTT TCT AGA CGG CAG GTC AGG T?3′；Bim?F：5′?CTG CAG ATA TGC GCC CAG AGA T?3′，Bim?R：5′?CACCAGGCGGACAATGTA ACG?3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PG對(duì)MCF?7細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)PG處理后MCF?7細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PG對(duì)MCF?7細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用，抑制作用呈時(shí)間濃度依賴。PG對(duì)MCF?7細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度（IC50）不盡相同，在24、48及 72 h的 IC50值分別為 11.8、6.2、3.9 μg/mL。見(jiàn)圖1。

2.2 PG對(duì)MCF?7細(xì)胞周期的影響

為了進(jìn)一步檢測(cè)PG對(duì)MCF?7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，我們采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果顯示在PG處理下，處于S期的MCF?7細(xì)胞數(shù)目顯著升高，作用效果呈濃度依賴性，結(jié)果提示PG能影響MCF?7細(xì)胞的增殖周期。PG處理后MCF?7細(xì)胞S期顯著減少、增殖指數(shù)下降，G1期顯著增加，提示PG通過(guò)抑制S期細(xì)胞DNA復(fù)制，從而抑制MCF?7細(xì)胞進(jìn)一步分裂增殖。（圖2）。

2.3 PG對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡的影響

為檢測(cè)PG對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡的影響，我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示PG能促進(jìn)MCF?7細(xì)胞凋亡，并呈劑量濃度依賴性。對(duì)照組MCF?7細(xì)胞凋亡率約 3.6%，1、2、4 μg/mL的 PG處理MCF?7細(xì)胞24小時(shí)后，其早期凋亡率呈濃度梯度上升趨勢(shì)，此外PG促凋亡效果呈劑量依賴性（圖 3）。

2.4 PG通過(guò)促進(jìn)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡

上面研究顯示PG能夠促進(jìn)MCF?7細(xì)胞凋亡，然而其具體機(jī)制不清。Bim是重要的凋亡相關(guān)蛋白，因此我們檢測(cè)PG是否通過(guò)Bim從而調(diào)控凋亡。RT?PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示PG能夠促進(jìn)MCF?7細(xì)胞內(nèi)Bim mRNA及蛋白的表達(dá)，并且呈濃度、時(shí)間依賴性（圖4）。

鑒于PG能夠上調(diào)MCF?7細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bim的表達(dá)，我們推測(cè)PG可能通過(guò)促進(jìn)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們采用特異性Bim小干擾siRNA沉默MCF?7細(xì)胞內(nèi)Bim表達(dá)，將Bim?siRNA及對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染MCF?7細(xì)胞，24小時(shí)后加入PG處理。RT?PCR及Western Blot結(jié)果顯示Bim?siRNA轉(zhuǎn)染后，MCF?7細(xì)胞內(nèi)Bim RNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示Bim?siRNA能抑制PG對(duì)MCF?7細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用，MCF?7細(xì)胞細(xì)胞早期凋亡率明顯減少，提示PG通過(guò)促進(jìn)Bim調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡（圖 5/6）。

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，研究顯示乳腺癌發(fā)病率已躍升至女性惡性腫瘤的第二位、并且具有年輕化趨勢(shì)。乳腺癌的高發(fā)病率和高死亡率已經(jīng)嚴(yán)重威脅著女性的身心健康，其預(yù)防和治療已成為國(guó)際急需解決的難題。

PG一類由多種細(xì)菌、放線菌產(chǎn)生的具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)特征是含有一個(gè)三吡咯環(huán)的大共軛體系骨架。PG具有抗腫瘤活性、免疫抑制活性和抗微生物活性，因而得到廣泛的研究。1977年Fullan等［9］首次證實(shí)PG在體內(nèi)具有抗腫瘤活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PG對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有抗腫瘤活性。鑒于PG良好的抗腫瘤活性，藥物學(xué)家已經(jīng)合成了多種PG衍生物，如GX15?070具有更好的免疫抑制活性和更低的毒性，已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ試驗(yàn)［10］。既往研究顯示PG能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性，其能對(duì)包括結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、淋巴細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用。Yenkejeh等［5］發(fā)現(xiàn)PG能抑制原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、效果呈劑量依賴性，并且PG是通過(guò)抑制survivin蛋白從而發(fā)揮其促凋亡活性。Cheng等［6］發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中PG通過(guò)激活JNK通路及抑制AKT/mTOR通路，從而促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡。Campàs等［11］發(fā)現(xiàn)PG能誘導(dǎo)慢性B細(xì)胞淋巴瘤性白血病患者的B細(xì)胞凋亡，細(xì)胞半數(shù)抑制率IC50位116±25 nM。Cheng等［7］發(fā)現(xiàn)口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞中PG通過(guò)P62/LC3?I/LC3?II通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡。此外PG還通過(guò)激活P38?MAPK磷酸化，從而誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡［12］。PG還具有拓?fù)洚悩?gòu)酶的雙重活性，能誘導(dǎo)單鏈和雙鏈DNA裂解，從到引起細(xì)胞周期阻滯，此過(guò)程伴或不伴有細(xì)胞凋亡［13］。

本文研究了PG抗乳腺癌的藥效作用，及其抗癌機(jī)制做了初步探討。MTT結(jié)果顯示PG能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、且與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)，作用24小時(shí)的IC50值為24 μg/mL。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PG能通過(guò)抑制S期MCF?7細(xì)胞DNA復(fù)制使其停滯與G2期，從而抑制其進(jìn)一步分裂增殖。隨后本研究采用流式細(xì)胞儀及TUNNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PG調(diào)控MCF?7細(xì)胞凋亡的作用，流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低濃度的PG在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞凋亡并不明顯，但隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)以及藥物濃度升高，MCF?7細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，提示PG誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞凋亡呈時(shí)間、藥物濃度依賴性。

Bim的全稱是Bcl2 interaction mediator of cell death，Bim接到凋亡刺激后就會(huì)與LC8一起從復(fù)合體上解離出來(lái)游離在胞漿中，并拮抗LC8和Bcl2的功能、從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。既往研究顯示Bim具有抗腫瘤活性，表達(dá)與多種惡性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌及非小細(xì)胞肺癌等，Bim表達(dá)上調(diào)能引起腫瘤細(xì)胞凋亡［15］。為了研究Bim在PG誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞凋亡中的作用，本研究采用RT?PCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PG能誘導(dǎo)MCF?7細(xì)胞中Bim高表達(dá)，提示PG可能通過(guò)Bim發(fā)揮其促凋亡作用。進(jìn)一步我們采用siRNA將MCF?7細(xì)胞中Bim沉默，流式細(xì)胞檢測(cè)顯示Bim沉默能抑制PG對(duì)MCF?7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)干擾RNA等試驗(yàn)手段發(fā)現(xiàn)靈菌紅素與MCF?7細(xì)胞增殖凋亡進(jìn)程，并且靈菌紅素能通過(guò)上調(diào)Bim，從而抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。研究提示靈菌紅素作為新型抗腫瘤藥物，具有一定的應(yīng)用前景，其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。