β2腎上腺素能受體的研究進展及其在興奮劑殘留檢測中的應用

高海嬌,徐 超,程古月,袁宗輝 (華中農(nóng)業(yè)大學 國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)/農(nóng)業(yè)部獸藥殘留檢測重點實驗室,湖北 武漢430070)

G 蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptros,GPCRs)是一種嵌入到脂質(zhì)雙層結構且完整的膜蛋白,分布于組織最廣泛的超大家族蛋白。根據(jù)跨膜結構的相似程度可分為以下5個亞家族:A 族視紫紅樣受體家族(包括α和β亞家族),B 族分泌素樣受體家族,C族谷氨酸鹽樣受體家族,D 族黏附樣受體家族和E 族frizzled/Taste2家族[1-2]。這些受體能夠被胞外配體激活,包括蛋白,多肽,光,激素,離子和小分子等,從而通過細胞膜向G 蛋白傳達信號[3]。β腎上腺素能受體(β-adrenergic receptor,β-AR)屬于G 蛋白偶聯(lián)受體A 族視紫紅樣受體,由7次跨膜螺旋組成。β-AR 具有各自的藥理學、生物化學和分子生物學的特點,主要分為以下3 類:β1-AR、β2-AR 和β3-AR[4]。β1-AR 大 多 存 在 于 心 血管,主要引起血管舒張和增加心輸出量,β2-AR 主要存在于支氣管平滑肌以及骨骼肌,造成支氣管舒張[5]。目前報道β3-AR 存在脂肪細胞,在調(diào)節(jié)并釋放瘦蛋白發(fā)揮重要作用[6-7]。

腎上腺素受體興奮劑與β-AR 有較好的親和性,因此該受體廣泛用于β腎上腺素類藥物與蛋白的結合研究。本文將重點介紹β2-AR 的結構和功能,并總結該受體的表達純化方式。分析β興奮劑受體蛋白中部分氨基酸突變對蛋白活性的影響以及β2-AR 在興奮劑殘留檢測中的應用。

1 β2腎上腺素能受體的結構及活性中心

1.1 結構組成β-AR 的組成包括:7 次螺旋跨膜(transmembrane,TM)結構,3個胞外環(huán)(extra-cellloop,ECL)和3 個 胞 內(nèi) 環(huán)(inner-cell-loop,ICL)。β2-AR 含 有3 個 糖 基 化 位 點(Asn6、Asn15 和Asn187)以及2個額外的螺旋肽,即螺旋Ⅷ和ECL2中段的短螺旋片段[8]。蛋白的7次跨膜結構經(jīng)過一系列的螺旋折疊,這些跨膜螺旋共同參與并形成一個“口袋”狀配基結合位點。與藥物的結合部位主要位于靠近胞外環(huán)的跨膜Ⅲ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ以及胞外環(huán)ECL2[9]?？拷麅?nèi)的跨膜氨基酸及胞內(nèi)環(huán)主要結合G 蛋白并參與G 蛋白信號的傳導以及β-arrestin的招募[10]。β2-AR 以單體或者組成型二聚體形式動態(tài)平衡的存在于細胞膜上,與細胞膜上的蛋白結合位點相互作用,并且維持一定的表達水平[11]。部分GPCR 以二聚體才能發(fā)揮功能如C 族γ氨基丁酸受體B,但β2-AR 的單體形式能夠保證蛋白發(fā)揮功能,并且與配體按1∶1結合[12-13]。

目前,人類的β2-AR 和鳥類的β1-AR 的晶體結構已經(jīng)解析。以人源β2-AR 為例,跨膜Ⅰ至Ⅶ對應的氨基酸包括以下:TMⅠ29～60,TMⅡ67～96,TMⅢ103～136,TMⅣ147～171,TMⅤ197～229,TMⅥ267～298 和TM Ⅶ305～328,胞內(nèi)環(huán)包括ICL1,61～66;ICL2,137～146;ICL3,230～266;胞外環(huán)包括ECL1,97～102;ECL2,172～196;ECL3,299～304;以及短肽螺旋Ⅷ[14]。ECL1,ECL2 和ECL3分別連接TM2、TM3、TM4、TM5 和TM5、TM6[15-16]。TM1的Lys60和螺旋8的Glu338氨基酸殘基參與蛋白二聚體的形成,該位點的突變同N端羰基化位點突變產(chǎn)生相同的結果,進一步說明了N 端羰基化位點通過調(diào)節(jié)蛋白的二聚而影響蛋白功能[17]。在TM3和TM6胞質(zhì)端,由(天冬氨酸/谷氨酸)精氨酸(色氨酸/酪氨酸)以及谷氨酸組成蛋白內(nèi)部非共價鍵來穩(wěn)定跨膜結構,β2-AR 是非保守序列,配基與蛋白結合時,離子鎖被破壞,因此突變該位點時將改變蛋白活性[18]。

1.2 活性位點KOOISTRA 等[19]研究了GPCR晶體結構并預測蛋白配體的功能。通過晶體結構與同源模型的建立,證明了蛋白構象與配基結合的微小差異足夠影響功能發(fā)揮。在結構模擬中,包含選定結合位點的氨基酸殘基靈活性或使用多晶體結構或與不同配基結合的蛋白模型,從而系統(tǒng)得考慮了蛋白質(zhì)構象和對接模擬的靈活性。目前人源β2-AR與配基結合的活性氨基酸以及作用機制已經(jīng)通過分子模擬或者對接等手段研究清楚[20]?；钚园被嶂饕挥赥M3,TM4,TM5,TM6,TM7 以及ECL2,表1總結了β2-AR 存在的化學鍵以及與藥物結合的活性氨基酸和作用方式。

1.2.1 二硫鍵 位于胞外環(huán)ECL2的2對半胱氨酸殘基Cys106/Cys191 和Cys184/Cys190 形 成 二 硫鍵,分別與ECL1和TM3相互作用,穩(wěn)定ECL2的結構[14]。早在1990年HENRIK 通過放射性配基結合試驗與二硫蘇糖醇競爭性結合β2-AR 受體,證明了有至少2對二硫鍵即Cys106-191,184-190參與了藥物與配體的結合[21]。

1.2.2 氫鍵 β2-AR 與配基結合的主要作用力,包括Asp、Ser、Trp、Phe和Asn。PLAZINSKA 等[22]模擬了人源β2-AR 蛋白活化與非活化狀態(tài)下與藥物分子(非諾特羅)的結合模式,中心結合結構域包括TM3,TM5,TM6 和TM7?；罨腁sp-113 既可以與帶羥基的配基以氫鍵結合,Asn312也可以與羥基或者氨基以氫鍵結合,但在非活化狀態(tài)下無法與藥物相互作用[23]。Ser203,Ser204,Ser207 通過氫鍵鍵合了大部分的β興奮劑藥物,同時,Ser165與Ser207聯(lián)合組成的活塞口袋也在蛋白發(fā)揮活性的過程中有著重要作用[24]。Trp286 和Phe290 殘基以高度保守的Trp286 為中心形成芳香環(huán)結合位點,Trp286作為蛋白的活性撥動開關,其旋轉(zhuǎn)異構體在蛋白活性與非活性狀態(tài)中相應得發(fā)生變化,從而促使藥物與蛋白結合[25]。

1.2.3 疏水作用力 疏水活性中心主要由Val114,Val117,Ile169 和Phe290 組 成。Val114 是 高 度 保守序列,與藥物的乙醇胺單鏈或芳香環(huán)結合,該位點突變會降低與藥物的特異性結合但不影響蛋白的表達或者折疊[26]。Val117,Ile169 和Phe290 分別與藥物的氨基和苯環(huán)相互作用,形成疏水中心[27]。

表1 人源性β2-AR 的活性氨基酸及其作用方式

1.2.4 鹽橋 β2-AR 中參與鹽橋形成的位點包括以下:Lys60(TM1)和Glu338(helix8),Asp113(TM3)以及Asp192(ECL2)和Lys305(TM7)。上述已經(jīng)提及TM1的Lys60和螺旋8的Glu338參與了蛋白二聚體的形成,該氨基酸殘基同時也在蛋白的一系列正確折疊后形成了鹽橋。分子模擬中可觀察到激動劑結合并激活蛋白的過程主要涉及2步,首先是配基上質(zhì)子化的氨基與Asp113(TM3)相互作用形成鹽橋,隨其螺旋5旋轉(zhuǎn)并暴露氫鍵結合位點與藥物相連[24]。分子模擬配基通過蛋白內(nèi)部的結合通道,發(fā)現(xiàn)ECL2中的Asp192和TM7的Lys305形成的鹽橋正處于配基進入蛋白活性中心的通路中,當配基正準備結合蛋白時,則破壞該鹽橋的形成,加速蛋白與配基的相互作用。不同類型的β腎上腺素受體模擬與藥物結合的氨基酸序列有一定差異,總的仍存在于ECL2和TM7上的氨基酸[28]。

2 β2興奮劑受體的表達方法

β2-AR 是7次跨膜蛋白,因其結構的特異性以及多次跨膜,該蛋白一直處于低水平表達。以下總結了目前β2-AR 的表達方法,主要分為真核、原核細胞表達,以及無細胞系統(tǒng)表達(表2)。

2.1 真核細胞表達

2.1.1 CHO 細胞系 Chinese hamster ovary cell line(CHO)為中國倉鼠卵巢細胞系穩(wěn)定表達株。HOFFMANN 等[29]在CHO 細胞中穩(wěn)定表達蛋白β1-AR、β2-AR 和β3-AR,表 達 量 分 別 為(0.37±0.08),(0.28±0.02)和(0.38± 0.08)nmol/g。BAKER 等[30]在前人的基礎上,對火雞β1-AR 進行突變,包括首尾氨基酸和內(nèi)環(huán)ICL3 部分堿基的刪除,以及熱穩(wěn)定性的6個堿基突變。在最終的突變體中,N 端刪除30個氨基酸,6個熱穩(wěn)定性突變體得到的蛋白含量最高,達到2.79 nmol/g,而野生型蛋白僅達到0.15 nmol/g。說明對蛋白的氨基酸適當?shù)倪M行增減以及突變,能夠改變蛋白的表達量,但是與藥物的特異性結合還需要進行后續(xù)分析。

2.1.2 HEK293 細 胞 Human embryonic kidney cells(HEK293)細胞為人源胚胎腎細胞。CHELIKANI等[31]構建了四環(huán)素誘導的HEK293高度表達倉鼠源β2-AR 蛋白的體系,該蛋白在膜蛋白中可得到蛋白(220.00±40.00)nmol/g,最終純化后可得到活性蛋白12.40 nmol/g。另外,王迪[32]用四板細胞瓶(15 cm)培養(yǎng)HEK293 細胞并表達倉鼠源β2-AR 蛋白,最終得到純化蛋白2.25 nmol/g,一次純化 最 終 得 到 蛋 白135 μg。WANG 等[33]也 在HEK293細胞中表達豬源β2-AR 蛋白,但在膜蛋白中含有蛋白約17.00～23.00 nmol/g,一次得到純化蛋白160.00μg。PARMAR 等[34]在β2-AR 的N 端添加了黃色熒光蛋白(YGP),在HEK293細胞中表達野生型與突變型的人源β2-AR 蛋白,野生型蛋白可得到(2.78±0.30)nmol/g蛋白,突變型蛋白的表達量比野生型降低了85%。

表2 β2-AR 的表達水平

2.1.3 Sf9細胞 桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)是利用桿狀病毒感染昆蟲細胞(spodoptera frugiperda,Sf9)從而獲得受體。該系統(tǒng)是目前表達G 蛋白較為成熟的一種表達體系,能夠保證蛋白功能的完整性。KOBILKA 等[35]最初通過N 端添加16個短肽作為信號序列和Flag標簽,C 端添加His標簽,在昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達蛋白獲得可溶性蛋白23.00 nmol,經(jīng)過鎳親和純化可獲得具有親和性的蛋白6.00 nmol。HAMPE 等[36]通過N 端麥芽糖標簽,C端6His標簽構建的β2-AR 融合蛋白分別在大腸桿菌和桿狀病毒感染昆蟲細胞中表達。桿狀病毒獲得了較大腸桿菌更高的表達量,大腸桿菌表達6.00 nmol/g,而 昆 蟲 細 胞 則 表 達17.00 nmol/g。PARKER 等[37]在昆蟲細胞中首次表達了一系列的C端截短的火雞β1-AR 致使表達量有極大的提高,方便了去垢劑的溶解并且依然保持其調(diào)節(jié)活性,通過用亮氨酸代替116位非保守的半胱氨酸也會使表達量提高。為增加蛋白的表達量,可對氨基酸進行突變,通常是增加GC含量,或者在不影響蛋白高級結構,將疏水氨基酸突變?yōu)橛H水性氨基酸。

2.2 原核細胞表達利用大腸桿菌表達真核β-AR蛋白比真核細胞表達簡單快速,但是原核細胞無法正確折疊蛋白也不能修飾,無法保證蛋白功能的完整性。β2-AR 是7次跨膜蛋白,對于大腸桿菌來說,表達跨膜蛋白會對大腸桿菌產(chǎn)生一定的毒性,細菌會停止生長從而導致表達量低,蛋白錯誤折疊[38]。DANYI等[39]在基因改造后的大腸桿菌KS303 的內(nèi)膜上表達重組人源β2-AR,并通過β興奮劑與放射性配基競爭結合蛋白,最終可得蛋白濃度達到(0.38±0.02)nmo L/g。WANG 等[40]利用了大腸桿菌無細胞表達體系表達,通過優(yōu)化豬源β2-AR 密碼子使之盡可能多在大腸桿菌提取物中表達,表達量可達到1.10 g/L(約22.00 nmo L/g),但是蛋白的活性比真核細胞表達的蛋白低。大腸桿菌無細胞表達體系是模擬原核細胞的胞內(nèi)環(huán)境,人為的不斷添加底物和能量以維持環(huán)境的穩(wěn)定,但因為缺少翻譯后修飾導致蛋白活性不高。

3 β2興奮劑受體的突變及親和性研究

目前突變研究最多的是人源β2-AR,包括蛋白的跨膜區(qū)點突變和N 端截短突變,表3總結了β2-AR 受體蛋白相關突變研究,蛋白的親和性主要參考抑制常數(shù)和半數(shù)有效量。

李曉娜[41]通過突變Asn6Gln和Asn15Gln除去N 端的2個糖基化位點,在HEK293細胞中表達后顯示膜蛋白的表達水平無顯著性變化(突變體蛋白的表達量為野生型的0.8倍),但降低了蛋白二聚體的形成,影響異丙腎上腺素作用下β2-AR 對G 蛋白信號的激活,而187位的糖基化位點不影響受體的二聚。YAO 等[42]對跨膜TM3和TM6區(qū)域組成離子鎖的氨基酸進行突變,包括Ile135Trp、Ala271Cys,同時突變5 個位點的絲氨酸。在SF9細胞中表達的突變體破壞了離子鎖,對于部分激動劑如沙丁胺醇來說不如完全激動劑如異丙腎上腺素的親和性,異丙腎上腺素的抑制常數(shù)比沙丁胺醇小20多倍。TM2的122位谷氨酸是位于螺旋表面的非保守氨基酸,與TM 4-3-5螺旋上的氨基相互作用形成,維持空間結構。ROTH 等[43]研究該氨基酸突變?yōu)槭杷被崛缟彼釙r,能近10倍得增加蛋白的熱穩(wěn)定性(野生型半衰期3.00 min,突變型Glu122Trp半衰期27.80 min),蛋白表達量也增加了1.5倍,但是藥物的親和性下降了50%,顯示對異丙腎上腺素的抑制常數(shù)增大了1.0 倍。PARMAR等[34]突變TM1帶電荷氨基酸和螺旋8的遠測部,通過生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移等方法測定蛋白二聚體的形成,突變Lys60Glu 和Glu338Ala后破壞了蛋白二聚體形成,使蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在眾多的突變體中,蛋白的表達量與野生型蛋白相比相差不多甚至更少,蛋白的親和力也沒有得到很大的提升,表明該受體非活性氨基酸的突變對蛋白的表達量和親和力沒有明顯改變。

表3 人源性β2-AR 的突變研究

4 β2興奮劑殘留篩選的受體分析方法

目前,興奮劑藥物殘留檢測主要還是以儀器方法和免疫學方法為主。儀器方法包括高效液相色譜法(HPLC)和氣/質(zhì)聯(lián)用分析法(GC/MS),最低檢測限分別可達到鹽酸克倫特羅0.25μg/L和萊克多巴胺0.50μg/L[44-45]。免疫分析法是以抗原抗體的特異性、可逆性結合為核心反應的分析方法,該方法具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、處理量大等特點。由于抗體的特異性高,只能同時檢測一種或少數(shù)幾種藥物[46-47],如LIU 等[48]合成半抗原SAL 并獲得抗體后建立酶聯(lián)免疫分析方法,測得的沙丁胺醇的最低檢測限為0.02μg/L。受體分析法是基于興奮劑與β2-AR 結合,類似于免疫分析法中抗原與抗體的結合,一般采用β2-AR 作為受體,結合多種標記技術以提高靈敏度,如同位素標記和酶標記等[49](表4)。

4.1 放射性受體分析方法CHARM 法采用放射免疫受體分析技術檢測興奮劑的殘留,通常先將待測樣品與一定量的受體反應,然后加入一定量的同位素(3H 或125I)標記藥物,反應平衡后,離心除去未與受體結合的標記藥物,測定結合的標記藥物的放射性,根據(jù)結合率推算樣品中待測藥物的含量[50]。二氫阿普洛爾(dihydroalprenolol,DHA)和氰基吲哚洛爾(cyanopindolol,CYP)作為β受體拮抗劑,能夠特異性結合β2-AR,并能與其余的興奮劑藥物產(chǎn)生競爭作用。NODA 等[51]最早測定β2-AR 蛋白活性并獲得高親和性的野生型蛋白,與[125I]CYP 的親和性Kd值為35.60 pmol/L。因此,該類方法皆通過放射性標記這2種藥物并測得β2-AR 對配體的親和性。

MEENAGH 等[52]在哺乳動物細胞系(CHO)表達受體蛋白,利用[3H]DHA 檢測了沙美特羅、馬布特羅、克倫特羅、西馬特羅和萊克多巴胺,其中對沙美特羅的親和性最高,半數(shù)抑制濃度(50%inhibition concentration(IC50))為87.50μg/L,抑制常數(shù)Ki為54.58μg/L,對萊克多巴胺的親和性最低(IC50為3 313.25μg/L,Ki為20 722.89μg/L)。BOYD 等[53]在哺乳動物細胞系(NCB20-D1 cells)中表達人源性可溶蛋白β2-興奮劑受體,也通過3H標記DHA 檢測上述5種藥,該類藥物對沙美特羅的親和性最高,其IC50為112.90μg/kg,最低檢測限為12.10μg/kg。DANYI等[39]在大腸桿菌KS303表達人源性可溶蛋白β2-興奮劑受體,通過[125I]CYP檢測該類藥物,測得對克倫特羅的親和性最高(IC50為15.67μg/L,Ki為6.58μg/L)。放射性受體分析方法靈敏度高,常用于檢測興奮劑與β2-AR 受體的競爭性結合,并研究后續(xù)G 蛋白偶聯(lián)受體的信號傳導功能[39]。但該方法采用了放射性同位素標記藥物,容易造成放射性污染并對人體有一定的傷害,阻礙了實際生產(chǎn)應用。

表4 β2-AR 的受體分析方法

4.2 酶標記受體分析方法酶標記受體法是基于受體配體間特異性相互作用和酶標記技術而建立的一種檢測技術,類似于ELISA 檢測方法。通過包被物即受體蛋白,酶標記物即常規(guī)的辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)以及競爭方法等方面的不同組合建立檢測模式。

CHENG 等[54]采用倉鼠的β2-興奮劑受體作為受體蛋白,在昆蟲細胞SF9 中表達,表達量為50.00μg/L。分別以HRP-克倫特羅,HRP-沙丁胺醇,HRP-萊克多巴胺作為酶標記藥物,建立了直接競爭方法,分別檢測這3 類藥物,孵育檢測時間為1 h,IC50分別為33.28,52.50和32.96μg/L,其中對萊克多巴胺識別力最強,其最低檢測量達到5.20μg/L。WANG 等[33]采用豬腎細胞的β2-興奮劑受體作為受體蛋白,在人胚腎細胞(HEK293)中表達。以HRP-克倫特羅為酶標記藥物,用于檢測豬肝腎組織中的克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺,IC50分別為34.00,53.00和63.00μg/L,最低檢測量達到4.00μg/L。WANG 等[40]克隆豬腎細胞的β2-興奮劑受體,采用無細胞表達蛋白系統(tǒng)純化表達,純化后的蛋白含量高達800.00 mg/L(約16 nmol/g),與真核細胞HEK239 細胞的總膜蛋白表達量(17.00～23.00 nmol/g)近似,但是無細胞表達后的蛋白活性比在HEK293中降低10%～20%,對克倫特羅,沙丁胺醇和萊克多巴胺的IC50分別為45.99,60.38和78.02μg/L,說明無細胞表達純化的活性蛋白含量減少。

5 展望

β2-AR 受體是G 蛋白偶聯(lián)受體最重要的一員,在受體信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用。但是因為7次跨膜結構導致不能大量異源表達,阻礙了蛋白的研究發(fā)展。本文綜述了β2-AR 蛋白在原核以及真核細胞的表達,真核細胞能夠保證蛋白活性,但是蛋白表達量只能達到nmo L/g,遠遠達不到蛋白的需求。在蛋白的突變研究中,包括點突變和截短突變,表達量和親和力與野生型蛋白相差不大,還需要深入研究。因該蛋白較強的生物活性和親和力,能夠與興奮劑相互作用,因此廣泛用于興奮劑的殘留篩選。目前檢測的藥物包括克倫特羅,萊克多巴胺,沙丁胺醇,最低檢測限為4μg/L,但是對其他興奮劑藥物的識別還不能達到檢測水平。放射性標記檢測結果比酶標記更為精確,但放射性物質(zhì)污染環(huán)境不能投入使用,只能在實驗室檢測中使用。因此,還需要繼續(xù)開發(fā)檢測方法,優(yōu)化檢測條件。

G 蛋白偶聯(lián)受體在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的信號轉(zhuǎn)導作用,因此需要更加清晰研究7次跨膜蛋白的分子結構以及與小分子藥物之間的相互作用機理。同時開發(fā)或改造不同的細胞表達系統(tǒng)為擴大蛋白表達做準備。