馬來(lái)穿山甲多種菌混合感染的細(xì)菌分離鑒定及小鼠的毒力試驗(yàn)

張安潔,楊 勇,肖望成,徐孝青,曾邦權(quán),肖 嘯,代飛燕?,秦 莉 (.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院學(xué)院,云南 昆明6500;.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 昆明6500;3.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,云南 昆明6504)

馬來(lái)穿山甲(pangolin Malay)也稱(chēng)爪哇鯪鯉、馬來(lái)鉆山甲,是鱗甲目物種,主要分布于中南亞國(guó)家。其嗅覺(jué)靈敏、視力弱、免疫器官不發(fā)達(dá)。是一種珍稀藥用動(dòng)物。李時(shí)珍在《本草綱目》中就有記載:“鱗可治惡瘡、瘋癥、痛經(jīng)、利乳[1]。”2007 年,國(guó)際自然與自然資源保護(hù)聯(lián)盟和保護(hù)國(guó)際經(jīng)過(guò)評(píng)估,馬來(lái)穿山甲從低危調(diào)整為瀕危等級(jí)[2]。目前關(guān)于馬來(lái)穿山甲的報(bào)道僅30篇,多為研究其繁殖、年齡及種群結(jié)構(gòu),而對(duì)于疾病診斷方面僅有1例,即陶立等[3]發(fā)表的1起穿山甲疫情的病原分析。所以本試驗(yàn)為我們了解馬來(lái)穿山甲及腸道致病菌提供了重要的臨床經(jīng)驗(yàn),也為我們后期保護(hù)馬來(lái)穿山甲提供了及其重要的理論依據(jù)。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是克雷伯菌屬中最為重要的一類(lèi)細(xì)菌,致病性在克雷伯菌屬中最強(qiáng),存在于人體的上呼吸道和腸道,可引起肺炎、呼吸道及泌尿道感染、腹瀉、敗血癥等[4];變形桿菌(Proteus species)屬腸道的正常菌群,是引起醫(yī)源感染的重要條件致病菌[5],廣泛分布于人和動(dòng)物的體表、黏膜及消化道,其產(chǎn)生的毒素可引起中毒,是一種常見(jiàn)的條件性致病菌[6];弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬,有11個(gè)基因種。其中,弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌和科氏檸檬酸桿菌常與人和動(dòng)物的感染有關(guān)[7],近年來(lái),該菌引起魚(yú)、蝦、鱉、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病的報(bào)道較多[8]。另外,小鼠、爬行動(dòng)物及鳥(niǎo)類(lèi)也會(huì)發(fā)生檸檬酸桿菌感染,并可通過(guò)糞便將病原菌排出體外。感染其他動(dòng)物,嚴(yán)重者死亡。大腸桿菌O83∶H1(Eheco83∶h1)是一種黏附性侵襲性大腸桿菌,主要定植并黏附于腸上皮細(xì)胞,引起腸道的某些慢性炎癥,腹瀉等癥狀。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源2017年9月云南省宜良某野生動(dòng)物收容中心收容了5只馬來(lái)穿山甲,都有嚴(yán)重的腹瀉癥狀,糞便呈黑綠色、且?guī)в忻撀涞哪c黏膜,其中2只并發(fā)打噴嚏及呼吸困難等癥狀。本試驗(yàn)無(wú)菌采集5只穿山甲的糞便棉試子及2份有呼吸道癥狀的鼻腔棉拭子。

1.2 主要試劑普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生化試劑盒購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司、DNA 提取試劑盒購(gòu)自云南晨綠生物科技有限公司、藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司、核酸染色劑購(gòu)自大連寶生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物昆明SPF 小鼠,6 周齡,體質(zhì)量18～25 g,購(gòu)買(mǎi)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 細(xì)菌分離鑒定采用三角區(qū)平板劃線(xiàn)法將細(xì)菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑選出不同形態(tài)大小的菌落,分別混與裝有2 000～3 000μL肉湯的試管內(nèi)培養(yǎng)。該試驗(yàn)共挑選出5種形態(tài)不同的菌落,其中2種分離自鼻腔棉試子,標(biāo)記為?-1、?-2;另外3種分離自糞便棉試子,標(biāo)記為?-3、?-4、?-5。

1.5 生化試驗(yàn)將純培養(yǎng)株菌分別接種于生化管內(nèi)。觀察并記錄生化結(jié)果,參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)。

1.6 菌株的16S rDNA PCR 鑒定參照所購(gòu)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取5株菌的核酸,將其作為PCR 模板。采用細(xì)菌16S r DNA 的通用引物(27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492 R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),對(duì) 菌 株 的16S r DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序鑒定,測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明?-2與?-5為同一種菌,選擇?-2進(jìn)行接下來(lái)的試驗(yàn)。并獲取與分離菌株16S r DNA 序列最相近的序列。采用MEGA3.0軟件,鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值分析[9]。

1.7 藥敏試驗(yàn)在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)將擴(kuò)增好的菌液分別吸取200μL注入普通瓊脂培養(yǎng)基內(nèi),用無(wú)菌三角棒將其涂布均勻,每種菌挑選10種藥敏片按標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)對(duì)分離的4株細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[10]。

1.8 動(dòng)物毒力試驗(yàn)此次毒力試驗(yàn)分為4 組,?-1為1組、?-2為2組、?-3為3組、?-4為4組。預(yù)試驗(yàn)每個(gè)組分為4小組,每小組4只體質(zhì)量相近的小鼠且雌雄各半,正式試驗(yàn)每組分7個(gè)小組,每小組6只體質(zhì)量相近的小鼠且雌雄各半。挑取經(jīng)純化鑒定的?-1菌液至2 m L的肉湯中,37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。利用微量分光光度計(jì)計(jì)算出菌液濃度為2.5×1012CFU/m L,將原菌液100 倍稀釋3 個(gè)梯度(2.5×1010,2.5×108,2.5×106CFU/m L)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),將原菌液及稀釋3個(gè)梯度的菌液分別腹腔注射給1組預(yù)試驗(yàn)的4組小鼠,每只小鼠0.5 m L,24 h觀察小鼠的死亡情況,得出引起動(dòng)物0%和100%死亡的劑量分別為2.4×106,2.4×1010CFU/m L。正式試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)5倍稀釋6個(gè)梯度,分別為1.20×107,6.00×107,3.00×108,1.50×109,1.25×1010,7.25×1010CFU/m L,將6個(gè)梯度的菌液分別注射給1 組正式試驗(yàn)的6 組小鼠,每只小鼠0.5 m L,另外1組作為對(duì)照組每只小鼠腹腔注射0.5 m L生理鹽水,觀察1周內(nèi)小鼠的死亡情況。以同樣的方法對(duì)?-2、?-3、?-4菌液進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)得出?-2、?-3、?-4引起動(dòng)物0%和100%死亡的劑量分別為7.2×105,7.2×109;8×106,8×1010;3.6×109,3.6×1013CFU/m L。正式試驗(yàn)同上,在預(yù)試驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)4倍稀釋6個(gè)梯度進(jìn)行人工感染小鼠,觀察1周內(nèi)小鼠死亡情況(表1)。

表1 梯度稀釋菌液濃度 CFU/m L

1.9 目的菌株的回收與鑒定將死亡小鼠進(jìn)行解剖,取病變較為明顯的部位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離鑒定培養(yǎng)和測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌菌落形態(tài)參照常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)觀察菌株[11]。?-1在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～18 h的細(xì)菌,生長(zhǎng)為灰白色凸起,挑之易拉成絲的菌落;?-2在血平板上有溶血現(xiàn)象;?-3在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為低突、灰色半透明、邊緣整齊而光滑的菌落;?-4在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為平滑、乳白色菌落。

2.2 鏡檢結(jié)果?-1為革蘭陰性粗短桿菌,單獨(dú)、成雙或短列狀排列;?-2為革蘭陰性?xún)啥蒜g圓的小桿菌;?-3為革蘭陰性橢圓形短桿菌;?-4為革蘭陰性長(zhǎng)桿菌(圖1～4)。

圖1 ?-1鏡檢結(jié)果(100×)

圖2 ?-2鏡檢結(jié)果(100×)

圖3 ?-3鏡檢結(jié)果(100×)

圖4 ?-4鏡檢結(jié)果(100×)

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果?-1與葡萄糖、甘露醇、H2S等反應(yīng)為陽(yáng)性,與鳥(niǎo)氨酸脫氫酶、甲基紅等反應(yīng)為陰性;?-2與葡萄糖、H2S、乳糖等反應(yīng)為陽(yáng)性,與鳥(niǎo)氨酸脫氫酶、甘露醇等反應(yīng)為陰性;?-3與葡萄糖、鳥(niǎo)氨酸脫氫酶、甘露醇等反應(yīng)為陽(yáng)性,與氧化酶、吲哚等反應(yīng)為陰性;?-4與氧化酶、吲哚乳糖等反應(yīng)為陽(yáng)性,與甲基紅、H2S等反應(yīng)為陰性(表2)。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 16S r DNA 擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株的16S r DNA 片段,與預(yù)期片段一致(圖5)。將?-1、?-2、?-3、?-4的序列分別提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),獲得的序列號(hào)依次為KF974479.1,HQ259933.1,MF148471.1,NC_017634.1,采 用BLAST 進(jìn)行比對(duì),得出?-1的序列與肺炎克雷伯菌的相似性最高、?-2與變形桿菌Z2株的相似性最高、?-3與弗氏檸檬酸桿菌的相似性最高、?-4與大腸桿菌O83∶H1的相似性最高,且同源性都在99%;每種菌選擇3～4株相關(guān)菌株,以鏈球菌作為外群,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)。?-1與肺炎克雷伯菌聚為一簇,?-2與變形桿菌聚一簇,?-3與檸檬酸桿菌聚一簇且與弗氏檸檬酸桿菌最接近,?-4與大腸桿菌聚一簇且與大腸桿菌O83∶H1最接近,由此確定?-1為肺炎克雷伯菌、?-2為變形桿菌、?-3為弗氏檸檬酸桿菌、?-4為大腸桿菌O83∶H1。

2.5 藥敏結(jié)果肺炎克雷伯菌和變形桿菌對(duì)頭孢三代及鏈霉素的敏感性較高,對(duì)喹諾酮類(lèi)耐藥;大腸桿菌O83∶H1對(duì)喹諾酮類(lèi)及新霉素敏感性好,對(duì)慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素耐藥;弗氏檸檬酸桿菌對(duì)大觀霉素及頭孢三代敏感性較好,對(duì)喹諾酮類(lèi)和青霉素類(lèi)耐藥(表3)。

圖5 4株菌株P(guān)CR 擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.?-1;2.?-2;3.?-3;4.?-4

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)肺炎克雷伯菌人工感染小鼠結(jié)果顯示,在感染后8 h,小鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、不愿走路、畏寒、喜蜷縮,10 h后出現(xiàn)呼吸困難呈憋喘狀,12 h后出現(xiàn)1只死亡,16 h后出現(xiàn)4只死亡,24 h后1.500×109CFU/m L 及以上組別6只小鼠全部死亡。變形桿菌在感染后8 h小鼠出現(xiàn)背毛粗亂、顫抖扎堆,12 h后出現(xiàn)腹瀉癥狀,16 h后1只小鼠死亡,24 h 后3 只 小 鼠 死 亡,48 h 后2.250×109CFU/m L 及以上組別6只小鼠全部死亡。弗氏檸檬酸桿菌在感染8 h后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、采食下降,18 h后出現(xiàn)腹瀉,24 h后1只死亡,36 h后4只死亡,48 h后2.500×1010CFU/m L及以上組別6只小鼠全部死亡。大腸桿菌O83∶H1在感染12 h后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、背毛粗亂、扎堆等現(xiàn)象,24 h后出現(xiàn)1死亡,36 h后出現(xiàn)3只死亡,48 h后出現(xiàn)4只死亡,60 h后6.125×1013CFU/m L 組別6只小鼠全部死亡,通過(guò)改良寇法:log LD50＝X K-i(∑P-0.5)(X K為最高對(duì)數(shù)劑量,i為相鄰兩對(duì)數(shù)劑量的差值,∑P為個(gè)劑量組的死亡率之和)計(jì)算出肺炎克雷伯菌、變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌及大腸桿菌O83∶H1的LD50 分別為4.37×108,1.15×108,1.29×109,4.15×1012CFU/m L(表4,5)。

圖6 16s r DNA 與相關(guān)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

2.7 發(fā)病小鼠病理剖檢與細(xì)菌分離鑒定剖解死亡小鼠,可見(jiàn)第1組小鼠肺臟、脾臟淤血腫脹、肝臟有壞死灶;第2組小鼠脾臟淤血腫大,腸系膜脫落、腸管變薄、有大量黃色透明的黏液性?xún)?nèi)容物;第3組小鼠肝臟和脾臟出現(xiàn)壞死;第4組小鼠腸系膜出現(xiàn)一定程度的炎癥且充血。取上述病變組織分別進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)及測(cè)序鑒定,結(jié)果與人工感染小鼠所使用的菌液相符。第1組為肺炎克雷伯菌、第2組為變形桿菌、第3組為弗氏檸檬酸桿菌、第4組為大腸桿菌O83∶H1。

3 討論

目前有關(guān)馬來(lái)穿山甲的報(bào)道極少,其腸道細(xì)菌分離鑒定未見(jiàn)報(bào)道。本次試驗(yàn)對(duì)于了解這4種菌在馬來(lái)穿山甲上的致病性表現(xiàn)提供了科學(xué)依據(jù)。

相關(guān)報(bào)道表明,肺炎克雷伯菌主要存在于機(jī)體的呼吸道及痰液中,導(dǎo)致咳嗽、嘔吐、腹瀉、呼吸困難等癥狀,感染羊表現(xiàn)為眼睛紅腫、咳嗽[13-15,23-24]。此次毒力試驗(yàn)感染昆明小鼠,表現(xiàn)出畏寒、喜蜷縮、呼吸困難呈憋喘狀,說(shuō)明該菌是導(dǎo)致馬來(lái)穿山甲出現(xiàn)呼吸困難等癥狀的主要致病菌;變形桿菌感染豬導(dǎo)致食欲減少、體溫升高、下痢等癥狀;感染揚(yáng)子鱷引發(fā)尿酸鹽沉積、腎病變等癥狀;感染水貂引發(fā)氣喘、血沫、下痢等癥狀[16-18]。毒力試驗(yàn)感染小鼠剖解見(jiàn)腸系膜脫落、腸管變薄有漿液性滲出,說(shuō)明該菌是引起馬來(lái)穿山甲出現(xiàn)腹瀉、腸黏膜脫落等癥狀的主要致病菌;弗氏檸檬酸桿菌是導(dǎo)致人和動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉癥狀的病菌之一。據(jù)報(bào)道該菌可引發(fā)魚(yú)類(lèi)皮膚潰爛、腐敗,肛門(mén)紅腫出血等癥狀,引發(fā)獼猴、仔豬、東北虎腹瀉,導(dǎo)致小寒尾羊急性敗血癥死亡,因?yàn)檩^強(qiáng)的菌株可穿過(guò)腸黏膜到達(dá)全身各個(gè)組織器官,導(dǎo)致機(jī)體廣泛出血至敗血癥死亡[19-21]。該菌感染小鼠臨床癥狀為精神萎靡、采食下降,剖解見(jiàn)脾臟、肝臟出現(xiàn)不同程度的壞死;大腸桿菌O83∶H1 主要定植并黏附于腸上皮細(xì)胞,引起腸道的某些慢性炎癥,腹瀉等癥狀。動(dòng)物毒力試驗(yàn)剖解小鼠見(jiàn)腸系膜充血伴有炎癥。

表4 肺炎克雷伯菌和變形桿菌人工感染小鼠死亡情況

表5 弗氏檸檬酸桿菌和大腸桿菌人工感染小鼠死亡情況

動(dòng)物毒力試驗(yàn)結(jié)果表明,在此次細(xì)菌感染中,變形桿菌的致病性最強(qiáng),其次是肺炎克雷伯菌、弗氏檸檬酸桿菌,大腸桿菌O83∶H1 的毒力相對(duì)要弱一些,且變形桿菌是導(dǎo)致馬來(lái)穿山甲出現(xiàn)腹瀉、腸黏膜脫落等癥狀的主要致病菌,肺炎克雷伯菌是導(dǎo)致馬來(lái)穿山甲出現(xiàn)呼吸困難等癥狀的主要致病菌,弗氏檸檬酸桿菌和大腸桿菌O83∶H1是導(dǎo)致馬來(lái)穿山甲出現(xiàn)腹瀉癥狀的主要致病菌,在2種菌的混合感染下穿山甲體內(nèi)正常菌群失調(diào),引起呼吸道和消化道的臨床癥狀。

藥敏結(jié)果,肺炎克雷伯菌和變形桿菌對(duì)頭孢三代及鏈霉素的敏感性高,與楊小敏等[22]對(duì)肺炎克雷伯菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致,與鄧晶榮[25]對(duì)變形桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比敏感性更高。弗氏檸檬酸桿菌對(duì)大觀霉素及頭孢三代敏感性較好,對(duì)喹諾酮類(lèi)和青霉素類(lèi)耐藥,與ZONG 等[26]對(duì)弗氏檸檬酸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比敏感性低。大腸桿菌O83∶H1對(duì)喹諾酮類(lèi)及新霉素敏感性好,目前未見(jiàn)有相關(guān)藥敏報(bào)道。綜上所述,本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果敏感性比報(bào)道中的高,推斷可能是因?yàn)樵隈R來(lái)穿山甲之前的生活中用藥少或在發(fā)病時(shí)還未及時(shí)用藥就被我們救助,機(jī)體未對(duì)抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性。