多重交叉置換擴增聯(lián)合羥基萘酚藍(lán)檢測膿腫分枝桿菌方法的建立

尹樹鵬，錢 城，言晨綺，李馬超，劉海燦，李相新，萬康林

膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus,M.abscessus)是最常見的快速生長型非結(jié)核分枝桿菌，也是抗生素耐藥性最強的分枝桿菌之一，其通常與傷口感染和膿腫形成有關(guān)，是免疫功能低下患者中慢性肺病的常見原因[1-2]。最新的證據(jù)表明，膿腫分枝桿菌復(fù)合群(M.abscessuscomplex)應(yīng)分為3個亞種，即膿腫分枝桿菌膿腫亞種、馬賽亞種和bolletii亞種[3-4]，膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌較常見，M.bolletii相對較少見[5-6]。膿腫分枝桿菌對許多抗生素的耐藥性高于馬賽分枝桿菌[7]。與馬賽分枝桿菌感染的治療高成功率(80%～90%)不同的是，膿腫分枝桿菌感染者抗生素治療后的治療成功率低于50%[8]?；诨虻钠未笮〔煌岢鰁rm(41)PCR測定法作為區(qū)分膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌的簡單方法[9]。雖然菌培養(yǎng)結(jié)合基因測序(16SrRNA，hsp65，rpoB，ITS)已被用于確定樣本中膿腫分枝桿菌的存在，但在常規(guī)臨床微生物學(xué)實驗室中進(jìn)行該操作既費時又昂貴，并且這種方法有可能提供相互矛盾的結(jié)果[10]。最近基于erm(41)基因PCR的測定提供了更快速的鑒別方法，但它需要在許多環(huán)境中可能無法獲得的儀器。在等溫條件下進(jìn)行的多重交叉置換擴增(multiple cross displacement amplification，MCDA)，是一種核酸擴增技術(shù)，已用于檢測許多病原體[11-12]。羥基萘酚藍(lán)(Hydroxynaphthol blue，HNB)是一種比色指示劑，可用于檢測擴增產(chǎn)物。因此，MCDA與HNB方法結(jié)合可以僅使用保持均勻溫度的簡單加熱器或水浴來檢測微生物。

本研究嘗試建立一種簡單、快速、可見、經(jīng)濟、有效的基于MCDA的檢測方法，用于檢測具有全長erm(41)基因的膿腫分枝桿菌，同時評估MAB-MCDA-HNB方法在使用純培養(yǎng)物和痰樣品檢測膿腫分枝桿菌中的表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 檢測試劑羥基萘酚藍(lán)購自北京海泰正元科技有限公司；Loopamp試劑盒購自榮研生物科技有限公司；TE緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；實時濁度儀(Loopamp，LA-320c)。

1.2菌株 從中國福建省福州市肺科醫(yī)院獲得23株膿腫分枝桿菌復(fù)合群臨床分離株。對所有菌株進(jìn)行rpoB，hsp65和ITS基因測序以區(qū)分膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和M.bolletii。此外，還使用了8種參考菌株(表1)。將細(xì)菌菌株在-70 ℃下儲存在20%(w / v)甘油7H9肉湯中。在使用之前，將菌株在Middlebrook 7H10上傳代培養(yǎng)。使用水煮法在100 ℃下從每個分枝桿菌菌落中用10 μL接種環(huán)提取的DNA，并通過Nanodrop ND-1000進(jìn)行定量。

表1 所使用的菌株信息
Tab.1 Bacterial strains used in this study

BacteriaSource of strainsNo. of strainsM. abscessusATCC 199771M. abscessusIsolated strains15M. massilienceIsolated strains8M. tuberculosis H37RvATCC 292741M. bovis BCG-1M. kansassiATCC 124781M. smegmatisATCC 194201M. phleiATCC 117581M. aviumATCC 252911Staphylococcus aureusATCC259231

1.3用于MAB-MCDA-HNB測定的引物設(shè)計 為了設(shè)計膿腫分枝桿菌特異性MCDA引物，下載了膿腫分枝桿菌的erm(41)基因的核苷酸序列(GenBank登錄號：KT185513.1)和馬賽分枝桿菌(GenBank登錄號：FJ358487.1)。比較膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌的核苷酸序列，膿腫分枝桿菌的erm(41)序列為522 bp，馬賽分枝桿菌由于兩個片段的缺失，erm(41)序列僅含有246 bp，基于該缺失序列設(shè)計了膿腫分枝桿菌特異性MCDA引物對。引物設(shè)計，引物序列和位置的詳細(xì)信息顯示在表2和圖1中。所有引物均由北京梓熙生物科技有限公司合成和純化到高效液相色譜(HPLC)等級。

表2 多重交叉置換擴增引物信息
Tab.2 MCDA primers information

PrimersSequences (5'-3')Length/bpF1TGCTAGCCGTCGAGCT16CP1GCAGGTCCGCTTCCGCTAT-TCGACACCTTCGTTCACG37C1GCAGGTCCGCTTCCGCTAT19D1GACATCTTCCTCGGCAAAC19R1AATGGCCGTCGCGGCCA17R2CCCTACCAAGTCACCAGC18D2ACCTGGTGCTGCAGCG16C2TACGGAGTCTCTTGACGCCG-GAAT24CP2TACGGAGTCTCTTGACGCCG-GAATGCTTCGCATGTTTGTGC41F2TGGCGAACAGGTGCTC16

引物序列的位點標(biāo)有下劃線，左箭頭和右箭頭顯示了使用的互補序列圖1 用于設(shè)計多重交叉置換擴增引物的所選基因的位置和序列 Fig.1 Location and sequence of selected gene used to design multiple cross displacement amplification primers

1.4MAB-MCDA-HNB測定的標(biāo)準(zhǔn)化 MAB-MCDA-HNB反應(yīng)在終體積為25 μL的擴增混合物中進(jìn)行。簡言之，每個反應(yīng)含有0.4 μmol/L的置換引物F1和F2，每個擴增引物C1和C2各0.8 μmol/L，擴增引物R1，R2，D1和D2各1.2 μmol/L，2.4 μmol/L交叉引物CP1和2.4 μmol/L交叉引物CP2, 1.25 μL的Bst DNA聚合酶(10 U)，12.5 μL的2×反應(yīng)混合物(Loopamp試劑盒)，1 μL HNB和1 μL DNA模板。離心混勻后，在實時濁度計(Loopamp，LA-320c)中進(jìn)行等溫擴增。

3種方法用于分析MCDA產(chǎn)物，包括濁度計，凝膠電泳和比色指示劑(HNB)。當(dāng)使用HNB時，擴增產(chǎn)物使顏色從紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，而沒有發(fā)生擴增反應(yīng)的管(陰性對照和空白對照)保持紫色。

通過將溫度從65 ℃改變到70 ℃確定最佳的擴增溫度。以每次反應(yīng)1 ng的水平使用膿腫分枝桿菌基因組DNA模板，并使用實時濁度法監(jiān)測反應(yīng)。

1.5MAB-MCDA-HNB的檢測限 使用膿腫分枝桿菌ATCC 19977基因組DNA梯度稀釋液(10 ng，1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg)為模板測定檢測限。我們將反應(yīng)時間設(shè)定為60 min。測試每種稀釋度的3個重復(fù)。

1.6MAB-MCDA-HNB測定的靈敏度和特異性 使用來自31株細(xì)菌菌株的基因組DNA分析MAB-MCDA-HNB的特異性和靈敏度(表1)。將MAB-MCDA-HNB的檢測與具有實時濁度和2%瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行比較。另外，用引物ermF(5′-GAC CGG GGC CTT CTT CGT GAT-3′)和ermR1(5′-GAC TTC CCC GCA CCG ATT CC-3′)擴增erm(41)基因[9]。PCR循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，然后35個循環(huán)(95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃延伸10 min。通過2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。使用來自31個菌株的DNA模板。

1.7MAB-MCDA-HNB人工模擬痰標(biāo)本檢驗 將MAB-MCDA-HNB測定應(yīng)用于人工模擬的痰標(biāo)本以評估其適用性。將膿腫分枝桿菌ATCC 19977在Middlebrook 7H10上孵育，然后培養(yǎng)使用生理鹽水將膿腫分枝桿菌(10-1至10-6)連續(xù)稀釋，7H10一式3份，并將100 μL等分試樣鋪在Middlebrook上，在37 ℃培養(yǎng)3 d后計數(shù)CFU。同時，將100 μL稀釋的膿腫分枝桿菌懸浮液(10-1至10-6)加入1 mL痰液中(無膿腫)。然后將加標(biāo)的痰液樣品液化并用N-乙酰半胱氨酸—4%NaOH去污并用于DNA提取。通過在100 μL TE緩沖液中100 ℃煮沸15 min提取DNA。然后1 μL DNA用于評估MAB-MCDA-HNB測定。將測試重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1膿腫復(fù)合群的鑒定 通過16SrRNA，rpoB，hsp65和ITS序列的多位點序列分析，鑒定出23株膿腫分枝桿菌和8株馬賽分枝桿菌的臨床分離株。

2.2最佳反應(yīng)溫度 我們在65 ℃至70 ℃的溫度下進(jìn)行了所有測試溫度的測定，在68 ℃下MAB-MCDA-HNB觀察到最快的擴增。

2.3MAB-MCDA-HNB的檢測限 在MAB-MCDA-HNB測定中使用系列稀釋的膿腫分枝桿菌桿菌參考菌株(ATCC 19977)基因組DNA，最后我們證實低至100 fg的DNA模板可以啟動MAB-MCDA反應(yīng)(圖2)。

使用膿腫DNA模板(10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg,100 fg,10 fg,1 fg)的系列稀釋液，通過濁度的實時測量來監(jiān)測擴增圖2 MAB-MCDA-HNB測定的檢測限 Fig.2 Limit of detection of MAB-MCDA-HNB assay

2.4測定的特異性和靈敏度 在31種細(xì)菌菌株中，只有來自M.abscessus的DNA顯示陽性結(jié)果，來自M.massilience、結(jié)核分枝桿菌、BCG、M.kansassi、M.smegmatis、M.phlei、M.avium和金黃色葡萄球菌的DNA模板表現(xiàn)為陰性結(jié)果(圖3)。

A產(chǎn)物通過實時濁度檢測；B產(chǎn)物通過顏色變化檢測；C產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測1-16，M. abscesuss; 17-24，M. massilience; 25，結(jié)核分枝桿菌H37Rv; 26，M. bovis BCG; 27，M. kansassi; 28，M. smegmatis，29，M. phlei; 30，M. avium; 31，金黃色葡萄球菌; 32，空白對照(DW)圖3 MAB-MCDA-HNB檢測M. abscessus中erm(41)基因的分析特異性Fig.3 Analytical specificity of MAB-MCDA-HNB for detecting erm (41) gene in M. abscessus

2.5erm(41)PCR產(chǎn)物的片段大小 使用ermF和ermR1引物通過PCR擴增兩種不同大小的產(chǎn)物。來自膿腫分枝桿菌的DNA模板較長產(chǎn)物(～700 bp)和來自馬賽分枝桿菌的較短產(chǎn)物(～400 bp)。其他細(xì)菌沒有PCR產(chǎn)物(圖4)。

M. massilience的擴增erm(41)產(chǎn)物小于M. abscessus的產(chǎn)物;1-16，M. abscesuss; 17-24，M. massilience; 25，結(jié)核分枝桿菌H37Rv; 26，M. bovis BCG; 27，M. kansassi; 28，M. smegmatis，29，M. phlei; 30，M. avium; 31，金黃色葡萄球菌; 32，空白對照(DW)圖4 膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和其他細(xì)菌的PCR擴增產(chǎn)物Fig.4 PCR amplified products from M. abscessus, M. massilience and other bacteria

2.6MAB-MCDA-HNB在模擬膿腫分枝桿菌痰標(biāo)本中的檢測限 1 mL模擬痰中最低可檢測的分枝桿菌數(shù)量約為1.7×103CFU(每次反應(yīng)17 CFU)。如果濃度低于1.7×103CFU/mL，則MAB-MCDA-HNB測定顯示陰性結(jié)果。

3 討 論

膿腫分枝桿菌是重要的致病菌，特別是在患有囊性纖維化和慢性呼吸道疾病的患者中。此外，膿腫分枝桿菌被認(rèn)為是最耐藥的分枝桿菌物種，其感染的治愈率不理想[13]，其對克拉霉素的誘導(dǎo)耐藥性被認(rèn)為是克拉霉素治療效率低下的一種解釋[14]。相比之下，馬賽分枝桿菌顯示出對克拉霉素的顯著易感性[9]。因此，對膿腫分枝桿菌的正確診斷和菌種水平鑒定具有臨床重要意義。

常用的臨床分枝桿菌鑒定方法是結(jié)合PCR基因測序，PCR-限制酶分析(PRA)和基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行培養(yǎng)。 PCR不完全正確，RPA方法可提供精確可靠的結(jié)果，但它需要更多的時間并且診斷過程比其他方法更復(fù)雜[15]。與GenBank數(shù)據(jù)庫相比，基因序列分析是將所有菌株分布到物種和亞種水平的金標(biāo)準(zhǔn)方法。雖然多位點序列分析(16SrRNA，hsp65，rpoB，ITS)已用于檢測樣品中分枝桿菌屬的存在，但在常規(guī)臨床微生物學(xué)實驗室中進(jìn)行這種方法耗時且昂貴且該方法僅限于專業(yè)實驗室[10]。一些研究數(shù)據(jù)表明，MALDI-TOF方法是一種快速有效的方法，可用于細(xì)菌菌種的鑒定[16]。該方法的主要缺陷是它不能區(qū)分亞種水平，包括膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和M.bolletii。此外，MALDI-TOF方法需要高度純化的培養(yǎng)，因此會帶來許多不便的過程[17]。在這項研究中，我們建立了一種方法，使用MCDA結(jié)合可視化結(jié)果來檢測臨床樣本中的膿腫分枝桿菌。

erm(41)基因僅在膿腫分枝桿菌復(fù)合群中發(fā)現(xiàn)，并且膿腫中的全長erm(41)基因賦予可誘導(dǎo)的大環(huán)內(nèi)酯抗性，這使人們質(zhì)疑大環(huán)內(nèi)酯治療膿腫性膿腫感染的有效性。相比之下，馬賽分枝桿菌中的erm(41)基因含有274 bp的缺失，導(dǎo)致無功能的erm(41)基因[9,18]。為了特異性檢測膿腫膿腫，我們設(shè)計了針對該274 bp基因序列的MAB-MCDA-HNB引物(圖1)。使用來自16株膿腫分枝桿菌，8株馬賽分枝桿菌和7種其他細(xì)菌菌株的DNA模板證實MAB-MCDA-HNB測定的特異性，擴增僅發(fā)生在膿腫分枝桿菌的測試中(圖3)。因此，MAB-MCDA-HNB測定提供了用于以高特異性檢測膿腫分枝桿菌的診斷工具。

除了高特異性外，MAB-MCDA-HNB方法能夠檢測從純培養(yǎng)物中提取低限100 fg的膿腫分枝桿菌DNA(圖2)。此外，擴增反應(yīng)結(jié)果可以根據(jù)顏色變化來判斷，因此，該測定所需的唯一設(shè)備是加熱塊或水浴，其在68 ℃下提供恒定溫度。

為了評估MAB-MCDA-HNB在臨床樣品中的實際應(yīng)用，通過MAB-MCDA-HNB方法分析人工污染的痰樣品。痰中膿腫分枝桿菌菌株MCDA的平均最低檢測限為1.7×103CFU / mL(每個反應(yīng)17 CFU)。

由于顏色差異，該方法的優(yōu)點是快速且方便地獲得反應(yīng)結(jié)果。其次它不需要大型測量儀器來加熱反應(yīng)，因此有可能應(yīng)用于初級和社區(qū)醫(yī)院。這項研究的一個限制是我們只使用人工痰作為樣本，我們沒有得到臨床樣本來測試敏感性和特異性。

據(jù)我們所知，這是目前第一次嘗試開發(fā)一種快速、可見的膿腫分枝桿菌檢測方法。這種新型MAB-MCDA-HNB方法為將來臨床樣本中快速檢測膿腫分枝桿菌提供了良好的選擇。

利益沖突：無

引用本文格式：尹樹鵬，錢城，言晨綺，等. 多重交叉置換擴增聯(lián)合羥基萘酚藍(lán)檢測膿腫分枝桿菌方法的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報，2020，36(1):40-44，49. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.193