感染旋毛蟲小鼠免疫能力的性別差異研究

王 敏, 羅曉磊, 沈 磊, 寧 曉, 肖朝江, 姜 北

旋毛形線蟲簡稱旋毛蟲，是一種寄生線蟲，可以感染人類及其他哺乳動(dòng)物而引起旋毛蟲病[1]。旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病[2]，主要因食用感染旋毛蟲的生肉或未煮熟的肉而引起，在全球范圍內(nèi)仍然是一種嚴(yán)重的傳染病[3]，而且嚴(yán)重影響豬肉生產(chǎn)和食品安全[4]。云南大理白族人民有生食豬肉的傳統(tǒng)習(xí)俗，因此感染旋毛蟲病的風(fēng)險(xiǎn)更大，是當(dāng)?shù)氐闹饕：π约纳x病之一。

旋毛蟲病的臨床表現(xiàn)不明確，臨床診斷比較困難[5]。目前，肌肉活檢和血清學(xué)檢查常被用于診斷人類旋毛蟲病[6]。旋毛蟲不同于其他蠕蟲，因?yàn)樗纳芷谑窃趩我凰拗黧w內(nèi)完成的，包括2個(gè)不同的寄生部位，腸上皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞[7]。感染性幼蟲侵入小腸上皮細(xì)胞，經(jīng)歷4次蛻皮大約在31 h發(fā)育成熟至成蟲階段，雌、雄成蟲交配，產(chǎn)生新生幼蟲，隨血液及淋巴液循環(huán)移行至全身各器官，并侵入骨骼肌內(nèi)發(fā)育，幼蟲周圍形成囊包后完成生命周期[8]。許多生物體的雄性和雌性通常容易感染同一種寄生蟲，但感染后在免疫反應(yīng)的強(qiáng)度或類型上會(huì)表現(xiàn)出明顯的差異[9]?？赡苁怯捎谛约に貙?duì)免疫系統(tǒng)的影響，從而導(dǎo)致寄生蟲和寄主性別之間在感染的發(fā)生率及對(duì)寄生蟲的耐受力上存在差異[10-11]。對(duì)大鼠和小鼠的研究證實(shí)，雄性的體液免疫和細(xì)胞免疫通常低于雌性[12]。曾有文獻(xiàn)報(bào)道旋毛蟲感染哺乳動(dòng)物及人類存在雌雄差異，但將小鼠的性腺切除后這種差異就有所減小[13]。因?yàn)樾坌晕锓N分泌的睪酮可以抑制機(jī)體的免疫功能，而雌性物種分泌的雌二醇會(huì)增強(qiáng)免疫功能。對(duì)田鼠進(jìn)行雌雄性別感染差異的實(shí)驗(yàn)中就證實(shí)雄性田鼠比雌性更易感染旋毛蟲[14-15]。另有研究證明雌二醇、黃體酮、睪酮在旋毛蟲的體外實(shí)驗(yàn)中也存在明顯差異，雌二醇及黃體酮抑制旋毛蟲蛻皮，而睪酮卻沒有影響[16]。新生小鼠接觸雙酚A至性成熟后感染旋毛蟲，由于性激素的影響導(dǎo)致雌性小鼠小腸成蟲數(shù)明顯低于雄性小鼠[17]。為進(jìn)一步明確性別與旋毛蟲感染之間的關(guān)系，本文就雌雄昆明小鼠感染旋毛蟲早期在免疫能力上是否存在差異進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠80只，5周齡左右，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全依照大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2蟲種來源 本實(shí)驗(yàn)所用旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.3主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀FACS Calibur(BD公司)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；CO2孵育箱(日本三洋電氣公司)；M700E倒置顯微鏡(日本尼康公司)；XFA6130型全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀(南京普朗生物醫(yī)學(xué)有限公司)；FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse CD25，均購自BD公司(貨號(hào)：557307，553075；批號(hào)：8127689，8066576)；IL-2、IL-4、IL-10 Elisa試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號(hào)：20190508；批號(hào)：20191107)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組與旋毛蟲感染 昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為8組，每組10只。4組為雌性小鼠，另4組為雄性小鼠，分別感染0、200、400、800條旋毛蟲。

1.5指標(biāo)測(cè)定 各組小鼠于感染后第7 d尾靜脈取血20 μL，加入至1.6 mL血細(xì)胞稀釋液中，混勻后于全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞組成比例；眼眶后靜脈叢采血，室溫靜置30 min后3 500 r/min離心10 min，收集血清用Elisa試劑盒測(cè)定血清中IL-2、IL-4、IL-10的濃度。處死小鼠后，稱體質(zhì)量，脾臟和胸腺組織質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%；部分組織于10%中性甲醛中固定24 h后，石蠟包埋，切片，HE染色觀察組織變化；部分脾臟組織用PBS制成細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液裂解后，離心重懸，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為1.0×106/mL，再加入FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體3 μL和 PE 標(biāo)記的抗小鼠CD25抗體4 μL 4℃避光孵育30 min，于流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+CD25+T 細(xì)胞(即免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的百分比。

2 結(jié) 果

2.1臟器指數(shù) 雌雄小鼠感染不同劑量旋毛蟲后的臟器指數(shù)如表1所示，正常雌雄性小鼠的脾臟指數(shù)無明顯差異，但正常及感染200條雌性小鼠的胸腺指數(shù)高于雄性小鼠(t0=3.248,P<0.05;t200=4.595,P<0.01)。小鼠感染不同劑量旋毛蟲后，雌性小鼠脾臟和胸腺指數(shù)均未見顯著變化，其比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.809,P>0.05；F=1.157,P>0.05)；雄性小鼠脾臟指數(shù)變化也不明顯，然而其胸腺指數(shù)較正常組有顯著的升高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.782,P<0.05)。表明感染旋毛蟲后，雄性小鼠的胸腺明顯腫大，而雌性小鼠未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

2.2白細(xì)胞組成比例 各組小鼠白細(xì)胞組成比例測(cè)定結(jié)果見表2，與正常組相比，感染旋毛蟲后雌雄小鼠的淋巴細(xì)胞百分比有不同程度的下降，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞百分比有不同程度的上升(F=3.875，P<0.01；F=2.460，P<0.05)。比較感染旋毛蟲后，雌雄小鼠的差異發(fā)現(xiàn)：雄性小鼠的白細(xì)胞組成比例變化更為顯著，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞百分比下降更明顯，而單核細(xì)胞和粒細(xì)胞百分比上升更多，其中，800條旋毛蟲感染小鼠后，與雌性小鼠相比，雄性小鼠的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tLY=2.604，P<0.05;tMO=-2.448，P<0.05)。

表1 感染不同劑量旋毛蟲小鼠臟器指數(shù)(n=10)
Tab.1 Organ index of mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)Organ index (%,female / male)SpleenThymus00.26±0.05 / 0.23±0.070.44±0.12 / 0.20±0.06①2000.25±0.03 / 0.23±0.040.43±0.02 / 0.31±0.06②4000.28±0.04 / 0.27±0.070.40±0.11 / 0.35±0.068000.29±0.04 / 0.24±0.070.41±0.05 / 0.34±0.07

Compared to female mice infected withT.spiralisat the same dose, ①P<0.01, ②P<0.05

表2 感染不同劑量旋毛蟲小鼠白細(xì)胞組成比例(n=10)
Tab.2 Composition of white blood cells in mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)WBC (%,female / male)LYMOGR080.30±3.57 / 78.53±3.615.37±1.34 / 5.12±2.1514.37±2.38 / 16.34±2.7420073.30±8.53② / 74.02±7.227.12±1.95 / 6.63±2.7219.58±7.67② / 19.34±4.8540074.28±4.95 / 69.70±7.39③7.39±1.67② / 8.43±1.60③18.31±3.45 / 21.84±5.89④80079.99±6.85 / 66.50±3.25④⑥5.44±3.01 / 11.00±1.27③⑥14.61±4.60 / 22.55±4.45④

WBC: White Blood Cell; LY: Lymphocyte; MO: Monocyte; GR:Granulocyte；TS:Trichinellaspiralis

Compared to the normal female group, ①P<0.01, ②P<0.05; compared to the normal male group, ③P<0.01, ④P<0.05; compared to female mice infected with T. spiralis at the same dose,⑤P<0.01, ⑥P<0.05.

2.3胸腺組織病理變化 結(jié)果見圖1，正常組中，雌雄小鼠胸腺組織的皮質(zhì)和髓質(zhì)的界限較為清楚，雌性小鼠的皮質(zhì)明顯多于髓質(zhì)，而雄性小鼠的皮質(zhì)與髓質(zhì)的比例相當(dāng)。感染200、400條旋毛蟲后，雌雄小鼠的皮質(zhì)與髓質(zhì)分界仍清楚，皮質(zhì)區(qū)可見排列整齊、密集的淋巴細(xì)胞，小葉間隔清晰可見，雌雄之間并不存在明顯差異。但感染800條旋毛蟲后，雌性小鼠的髓質(zhì)比例有所減小，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞排列不整齊，而雄性小鼠的髓質(zhì)中可見有小血管分布，皮質(zhì)變化不明顯。

2.4脾臟組織病理變化 結(jié)果見圖2，正常組中，雌雄小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓和紅髓分界以及脾小梁雌性較雄性更為清晰。感染200、400、800條旋毛蟲后，雄性小鼠白髓和紅髓的分界較雌性更為清晰。雄性小鼠的脾小梁較為密集，而雌性小鼠的脾小梁則較為稀疏。雌雄之間在結(jié)構(gòu)上確實(shí)存在差異，但在感染的劑量上并未呈現(xiàn)出明顯差異。

2.5血清IL-2、IL-4、IL-10含量測(cè)定 結(jié)果見表3，與正常組相比，感染旋毛蟲后雌性小鼠的IL-2上升，雄性小鼠下降；IL-4含量雌雄小鼠均上升(F=5.664,P<0.05，P<0.01)；除感染400條旋毛蟲組外，IL-10含量均有不同程度的上升。比較旋毛蟲感染后的雌雄小鼠差異發(fā)現(xiàn)：IL-2的含量雌性上升，雄性下降，且感染800條旋毛蟲組雄性顯著低于雌性(t=3.615,P<0.05)。IL-4含量雄性上升趨勢(shì)高于雌性，IL-10含量變化趨勢(shì)雄性高于雌性，但各組之間差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.170,P>0.05)。

表3 感染不同劑量旋毛蟲小鼠白細(xì)胞介素含量(n=10)
Tab.3 Interleukin levels in mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)Interleukin levels (ng/L,female / male)IL-2IL-4IL-100400.84±29.56 / 379.53±23.3259.25±7.92 / 42.90±13.67192.94±4.76 / 202.73±27.30200414.73±100.86 / 361.04±55.8370.69±22.60 / 89.57±17.03③205.86±27.73 / 227.01±21.85400464.08±98.41 / 350.95±42.9169.89±16.65 / 94.95±31.34③191.83±37.66 / 192.88±41.36800478.16±49.67 / 346.80±38.66⑥91.69±15.20② / 102.81±18.13③238.01±7.44 / 231.71±47.00

TS:Trichinellaspiralis

Compared to the normal female group, ①P<0.01, ②P<0.05; compared to the normal male group, ③P<0.01, ④P<0.05; compared to female mice infected with Trichinella spiralis at the same dose, ⑤P<0.01, ⑥P<0.05.

2.6脾臟免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+(即免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)比例，結(jié)果表明，與正常組相比，感染旋毛蟲后，雌性小鼠的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均上升，但各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.037,P>0.05)。感染400條旋毛蟲后，與雄性正常小鼠比較，其免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯上升，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.088,P<0.01)，但同一感染量雌雄之間進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t0=-0.485,P>0.05;t200=0.813,P>0.05;t400=-1.715,P>0.05;t800=0.526,P>0.05)，結(jié)果見圖3。

3 討 論

旋毛蟲寄生在寄主體內(nèi)，在不嚴(yán)重?fù)p害寄主的情況下逃避寄主的免疫，從而平衡與寄主免疫系統(tǒng)的關(guān)系。旋毛蟲侵襲小腸時(shí)會(huì)引起腸道細(xì)胞的高收縮，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞增多，從而刺激炎癥的產(chǎn)生，進(jìn)而誘發(fā)Th1和Th2免疫反應(yīng)。Th1細(xì)胞分泌IL-2及IFN-γ，介導(dǎo)細(xì)胞毒及局部炎癥反應(yīng)，清除細(xì)胞中的病毒、細(xì)菌及寄生蟲。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-10刺激B細(xì)胞增殖及產(chǎn)生抗體，清除游離的微生物。然而，過于強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)不僅會(huì)殺死外來物質(zhì)，還會(huì)影響寄主自身。因此，當(dāng)存在過強(qiáng)的免疫反應(yīng)時(shí)，免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)被激活，與Th1、Th2共同發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[18-20]。

臟器指數(shù)結(jié)果顯示雌雄小鼠感染不同數(shù)量旋毛蟲后，僅對(duì)雄性小鼠胸腺指數(shù)有一定影響。胸腺和脾臟的組織學(xué)檢查結(jié)果顯示胸腺的結(jié)構(gòu)雌雄之間并不存在明顯差異，但脾臟組織學(xué)檢查結(jié)果卻顯示感染旋毛蟲后對(duì)雌性小鼠脾臟的影響較為顯著。白細(xì)胞組成比例結(jié)果顯示雌雄小鼠感染不同數(shù)量旋毛蟲后其淋巴細(xì)胞百分比降低，單核細(xì)胞、粒細(xì)胞百分比較正常組升高。此結(jié)果與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致，血液或組織中嗜酸性粒細(xì)胞水平的增加歷來被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物寄生蟲感染的一個(gè)顯著特征，且嗜酸性粒細(xì)胞的應(yīng)答并不呈現(xiàn)出感染劑量依賴性。IL-2含量測(cè)定結(jié)果顯示感染旋毛蟲的雌性高于雄性。IL-4、IL-10含量雄性均高于雌性。Treg中 CD4+CD25+的比例顯示與正常對(duì)照組相比其比例均上升，感染200、800條旋毛蟲的雄性小鼠低于雌性，其余各組 CD4+CD25+的比例雄性高于雌性。根據(jù)以上結(jié)果提示感染旋毛蟲后雄性小鼠的免疫能力強(qiáng)于雌性小鼠。

有文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]旋毛蟲感染哺乳動(dòng)物及人類存在雌雄差異，因?yàn)樾坌晕锓N分泌的睪酮可以抑制機(jī)體的免疫功能，而雌性物種分泌雌二醇會(huì)增強(qiáng)免疫功能。因而推測(cè)可能是由于性激素的分泌，從而導(dǎo)致雌性的Th1免疫反應(yīng)強(qiáng)于雄性，刺激IL-2的分泌使其含量高于雄性，IL-2含量的升高促進(jìn)寄主的細(xì)胞免疫。雄性的Th1免疫較弱可能轉(zhuǎn)而增強(qiáng)Th2免疫，進(jìn)而導(dǎo)致體液免疫增強(qiáng)即刺激Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10的分泌，故IL-4、IL-10的含量雄性小鼠高于雌性小鼠[22]。IL-10含量的升高會(huì)增強(qiáng)Treg的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致 CD4+CD25+的比例與正常對(duì)照組相比雌雄均升高且雄性高于雌性。在旋毛蟲感染中，嗜酸性粒細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以刺激樹突狀細(xì)胞和CD4+細(xì)胞進(jìn)而刺激IL-10的產(chǎn)生。在感染旋毛蟲后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，嗜堿性細(xì)胞和肥大細(xì)胞是Th2細(xì)胞因子的重要供體。且結(jié)果顯示感染旋毛蟲后粒細(xì)胞比例雄性高于雌性，因此導(dǎo)致雄性小鼠的Th2免疫反應(yīng)強(qiáng)于雌性[23-25]。有研究報(bào)道旋毛蟲在感染后10-28 h侵入小腸粘膜層，停留2-3周。感染后1、2周小腸的Treg細(xì)胞數(shù)量增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示Treg(CD4+CD25+)比例在感染旋毛蟲后升高，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[26]。但是各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果并未呈現(xiàn)出顯著的感染劑量依賴性，可能是由于寄主感染較多數(shù)量旋毛蟲后，在空間(即在腸道上皮細(xì)胞)和營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生激烈競爭，以及寄主對(duì)旋毛蟲的排出作用，導(dǎo)致高劑量感染后可能對(duì)寄主免疫產(chǎn)生抑制作用[27]。對(duì)于寄主在旋毛蟲感染后引起的反應(yīng)存在很大變異，這是由遺傳決定的?？赡芘c主要組織相容性復(fù)合體(MHC)有關(guān)，也可能與非MHC相關(guān)基因有關(guān)[28]。結(jié)合以上臟器指數(shù)、白細(xì)胞組成比例、胸腺和脾臟組織學(xué)檢查、IL-2、IL-4、IL-10含量以及Treg(CD4+CD25+)的比例可以看出，感染旋毛蟲后雄性小鼠的免疫反應(yīng)強(qiáng)于雌性小鼠，但造成這種現(xiàn)象的主要原因還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：無

引用本文格式：王敏，羅曉磊，沈磊, 等. 感染旋毛蟲小鼠免疫能力的性別差異研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):01-06. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.189