miRNA-41調(diào)控c-myc在宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

朱亞 張偉 柯麗娜 朱承義 李斌

宮頸癌是全球女性中發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率逐年上升。宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展作用機(jī)制復(fù)發(fā)，已知眾多分子參與調(diào)控這一錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，而針對(duì)單一基因設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)藥物對(duì)腫瘤遏制效果并不理想[1,2]。侵襲是惡性腫瘤的重要特性之一，其與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密不可分[3,4]；EMT以上皮細(xì)胞特性的喪失及其間質(zhì)細(xì)胞特性的獲得為主要特征，能使局限性生長(zhǎng)的腫瘤發(fā)展成轉(zhuǎn)移性腫瘤，提高其侵襲能力[5]。腫瘤發(fā)生EMT過(guò)程中的標(biāo)志是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Vimentin 表達(dá)升高， 細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞間連接變得疏松等[6]。能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的因素比較多，包括炎癥刺激、化療藥物、紫外線、組織損傷、缺氧等[7]。MicroRNA即微小RNA(miRNA)，是指長(zhǎng)度21～25 nt的小型非編碼RNA家族，其能夠識(shí)別特定的目標(biāo)mRNA，可通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)抑制翻譯過(guò)程而發(fā)揮調(diào)控作用[8]。miRNA-41在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，并能夠通過(guò)抑制PTEN、PDCD4、p53等抑癌基因的翻譯過(guò)程參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生[9]。c-myc蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，宮頸癌組織中伴隨有c-myc的過(guò)度表達(dá)和擴(kuò)增[10,11]。本文探討miRNA-41調(diào)控c-myc在宮頸癌EMT中的作用，以明確miRNA-41的作用機(jī)制，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HeLa宮頸癌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室，培養(yǎng)于含10%熱滅活FBS，4 mmol/L谷氨酰胺，50 U/ml青霉素和50 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃與5%CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，每隔3～5 d進(jìn)行傳代。miRNA-41 mimic與miRNA-41 NC購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞隨機(jī)分為3組:空白組、對(duì)照組與miRNA-41組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%后，對(duì)照組與miRNA-41組分別用EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miRNA-41 NC 與miRNA-41 mimic，轉(zhuǎn)染終濃度為10 nmol/L，轉(zhuǎn)染后12 h更換培養(yǎng)液，空白組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miRNA-41表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，收獲細(xì)胞，用刮棒刮取細(xì)胞、4℃、1 000 r/min離心10 min，去上清，收集細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，采用SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)系統(tǒng)檢測(cè)miRNA-41表達(dá)，以GAPDH為反應(yīng)體系內(nèi)參照。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù) 收集轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞分別接種于96孔板，約5×103個(gè)/孔，轉(zhuǎn)染后24 h與36 h分別去除96孔板每孔中培養(yǎng)液，每孔加入180 μl新鮮DMEM培養(yǎng)液，再加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去除孔內(nèi)培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩培養(yǎng)10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲指數(shù) 將分裝好的Matrix 從-20℃冰箱中取出，在每個(gè)Transwell 小室中鋪膠100 μl，溫育3 h夾起Transwell 小室，向下室中加入600 μl含15%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，將細(xì)胞密度調(diào)整為4×105個(gè)/ml取100 μl細(xì)胞懸液垂直加入到Transwell小室中，培養(yǎng)24 h取出小室、固定細(xì)胞并精心染色，鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照，記錄細(xì)胞相對(duì)侵襲指數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染后36 h，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，離心后棄去上清，加重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%冰乙醇2～3 ml，吹打均勻，于4℃冰箱固定24 h以上。1 000 r/min 5 min離心棄去乙醇，重懸后加入碘化丙啶染液(PI染液，100 μg/ml)，室溫避光混合30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。上述實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取平均值。

1.7 Western Blot檢測(cè)c-myc與Vimentin表達(dá) 轉(zhuǎn)染后36 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，取細(xì)胞，加入100 μl預(yù)冷的蛋白裂解液，裂解蛋白后分裝并在-70℃冰箱中保存。取20 μg蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)應(yīng)用商品化抗c-myc抗體和抗Vimentin抗體 (Abcam)，以GAPDH(Abcam)為內(nèi)參照。

2 結(jié)果

2.1 3組miRNA-41表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，miRNA-41組的miRNA-41表達(dá)水平顯著高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)，空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別24 h36 hmiRNA-41組23.44±2.4834.77±4.51對(duì)照組1.44±0.221.51±0.33空白組1.23±0.311.33±0.11 F值67.30298.022 P值0.0000.000

2.2 3組細(xì)胞增殖指數(shù)比較 轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，miRNA-41組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)，空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組別24 h36 hmiRNA-41組134.59±24.03155.32±31.48對(duì)照組99.24±10.4298.76±9.22空白組95.92±9.7896.38±10.33 F值9.83312.430 P值0.0010.000

2.3 3組細(xì)胞周期比較 轉(zhuǎn)染后36 h，miRNA-41組的G1期比例較對(duì)照組和空白組顯著降低(P<0.05)，S期+G2期比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 3組細(xì)胞侵襲指數(shù)比較 轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，miRNA-41組的細(xì)胞侵襲指數(shù)顯著高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)，空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 c-myc與Vimentin表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染后36 h，miRNA-41組的c-myc與Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和空白組，空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

組別G1期S期+G2期miRNA-41組51.34±0.3348.77±0.24對(duì)照組60.00±0.6539.53±0.61空白組60.98±0.3338.92±0.55 F值5.7754.984 P值0.0080.012

組別24 h36 hmiRNA-41組1.56±0.441.78±0.56對(duì)照組1.02±0.081.07±0.11空白組1.03±0.111.06±0.05 F值23.10322.881 P值0.0000.000

圖1 3組c-myc與Vimentin表達(dá)比較

3 討論

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。宮頸癌患者5年生存率一直不高，腫瘤轉(zhuǎn)移是宮頸癌致死的主要原因[12]。miRNAs 作為調(diào)控基因表達(dá)的一類非編碼小RNA，可參與機(jī)體大多數(shù)的生物學(xué)和病理學(xué)的進(jìn)程，其主要通過(guò)與靶mRNA的核苷酸序列的堿基配對(duì)與互補(bǔ)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)。有研究顯示miRNA-41在宮頸癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)為高表達(dá)，反義miRNA-41能夠抑制宮頸癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)[13]。還有研究顯示轉(zhuǎn)染反義miRNA-41寡核苷酸后，宮頸癌細(xì)胞增殖與侵襲能力被抑制[14]。還有學(xué)者采用qRT-PCR檢測(cè)miRNA-41的表達(dá)水平，結(jié)果顯示正常組織中miRNA-41表達(dá)水平很低，而宮頸癌組織中的表達(dá)量增加10倍以上[15]。宮頸癌的播散是指惡性宮頸癌在生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中向鄰近組織直接侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過(guò)程，其中主要的特征為細(xì)胞侵襲。這個(gè)過(guò)程的發(fā)生發(fā)展一般都伴有細(xì)胞極性消失、與內(nèi)皮細(xì)胞基底膜的粘附能力增強(qiáng)、細(xì)胞間的粘附能力下降以及細(xì)胞骨架重構(gòu)等[16,17]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，miRNA-41組的miRNA-41表達(dá)水平顯著高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)；細(xì)胞增殖指數(shù)與侵襲指數(shù)顯著高于空白組和對(duì)照組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后36 h，miRNA-41組的G1期比例相對(duì)于對(duì)照組和空白組顯著降低(P<0.05)，S期+G2期比例則顯著增加(P<0.05)，表明miRNA-41的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。

癌細(xì)胞可以存在于各種表型狀態(tài)，其細(xì)胞可以保持上皮性狀與間充質(zhì)狀態(tài)，可使癌細(xì)胞具有腫瘤發(fā)生潛力[18]。EMT是一種生物過(guò)程，癌癥相關(guān)的EMT有助于增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，多種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT[19]。Vimentin是中間纖維蛋白的一種，Vimentin高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞具有高度侵襲性，其在腫瘤中的表達(dá)上調(diào)是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志[20]。并且Vimentin的表達(dá)的逐漸上升是隨著分化級(jí)別的降低而進(jìn)行的，在宮頸癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。c-myc癌基因的編碼蛋白由49個(gè)氨基酸殘基組成，在宮頸癌組織中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)c-myc 的過(guò)度表達(dá)[21]。有研究顯示在宮頸組織、宮頸炎癥，宮頸浸潤(rùn)癌，c-myc的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)[22,23]。c-myc 基因擴(kuò)增及過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖及增殖后結(jié)局密切相關(guān)，腫瘤惡性程度越高，c-myc的表達(dá)率越高[24,25]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后36 h，miRNA-41組的c-myc與Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和空白組，空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明過(guò)表達(dá)miRNA-41能促進(jìn)c-myc與Vimentin蛋白表達(dá)，從而促使EMT的發(fā)生，提高腫瘤增殖性與侵襲性。本研究也有一定的不足，沒(méi)有明確miRNA-41在宮頸癌的靶基因，miRNA-41對(duì)EMT的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步深入分析。

綜上所述，miRNA-41在宮頸癌細(xì)胞中的高表達(dá)能夠促進(jìn)c-myc與Vimentin蛋白表達(dá)，從而促使EMT的發(fā)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，提高細(xì)胞增殖性與侵襲性。