lncRNA SNHG12在乳腺癌中的表達(dá)水平及臨床意義

張延濤 孫勇 張遠(yuǎn)鵬

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，研究顯示，全球每年有大約130萬(wàn)新增乳腺癌患者，其中約50萬(wàn)乳腺癌患者死亡，病死率居女性惡性腫瘤前列[1]。目前乳腺癌發(fā)病率仍以3%的速度不斷增加，且呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的身體健康[2]。手術(shù)聯(lián)合放療、化療仍是治療乳腺癌的有效措施，一定程度上降低了該病的病死率，但對(duì)于部分晚期患者的治療仍未達(dá)到滿意效果[2]。研究表明，對(duì)乳腺癌預(yù)后的準(zhǔn)確判斷是提高乳腺癌治療效果的關(guān)鍵[3]。然而乳腺癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素、多基因參與的復(fù)雜的過(guò)程，目前仍缺乏有效的生物標(biāo)志物來(lái)反映乳腺癌患者的預(yù)后[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，lncRNA具有一系列生物學(xué)功能，在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞分化調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等多種生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用，可能作為腫瘤學(xué)臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。小核仁RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12)是一種具有低編碼概率的lncRNA，與膠質(zhì)瘤等多種腫瘤患者的臨床特征有關(guān)，可能作為腫瘤預(yù)后的良好指標(biāo)[4]。然而lncRNA SNHG12與乳腺癌疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系尚不清楚?；诖?，本研究通過(guò)探討SNHG12在乳腺癌中的表達(dá)水平，分析其臨床意義，以期為乳腺癌的治療及預(yù)后提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2013年10月在我院行手術(shù)切除的85例乳腺癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距癌組織邊緣>5 cm處)，患者均為女性，年齡30～78歲，平均年齡(50.42±18.65)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。手術(shù)切除組織后，用0.9%氯化鈉溶液洗去血污，迅速凍存于-80℃液氮之中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)確診；③患者術(shù)前未經(jīng)任何化療、放療或其他抗腫瘤治療；④患者自愿參與、配合本研究，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①心、肝、腎等重要臟器功能障礙患者；②精神精疾病患者；③嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器：Trizol試劑、氯仿、異丙醇、RNA提取、焦碳酸二乙酯等試劑均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Thunderbird SYBR qPCR Mix購(gòu)自北京百靈克生物科技有限公司，內(nèi)參β-actin的引物探針由上海生工生物有限公司合成。

1.3.2 RNA的提?。喝∪橄侔┙M織及對(duì)應(yīng)癌旁組織3 mm2的樣本解凍后，超聲勻漿，加入1 ml Trizol試劑，充分混勻并靜置10 min，加入300 μl氯仿并混勻，4℃、15 000 r/min離心機(jī)上離心10 min，棄上清，再加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，離心后棄上清，靜置15 min，晾干后加入焦碳酸二乙酯水溶解，瓊脂糖凝膠電泳后，測(cè)定RNA濃度及純度。

1.3.3 qRT-PCR：提取RNA并測(cè)定RNA濃度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用Thunderbird SYBR qPCR Mix進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)SNHG12的表達(dá)水平，反應(yīng)體系20 μl，qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃：1 min；95℃：30 s；60℃：40 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3組重復(fù)，采用2-ΔΔCT法對(duì)SNHG12表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 隨訪 隨訪日期自手術(shù)之日起至2018年10月31日，對(duì)所有患者進(jìn)行復(fù)查或電話隨訪，隨訪時(shí)間為5年，記錄患者隨訪期間的生存情況。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SNHG12在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平比較 乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG12表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

類別lncRNA SNHG12乳腺癌組織2.84±1.06癌旁組織 1.07±0.52t值13.821P值0.000

2.2 lncRNA SNHG12表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 以乳腺癌患者lncRNA SNHG12水平平均值為分界線，高于平均值為高表達(dá)，低于平均值為低表達(dá)。乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG12表達(dá)情況與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及雌激素受體(ER)有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、孕激素受體(PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體(Her2)無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 影響乳腺癌患者預(yù)后因素的Cox回歸分析 Cox模型單因素分析結(jié)果顯示：腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA SNHG12是影響乳腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素；Cox模型多因素的分析結(jié)果顯示：腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA SNHG12是影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

2.4 lncRNA SNHG12表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后隨訪5年，共有15例患者死亡，其中l(wèi)ncRNA SNHG12高表達(dá)乳腺癌患者的5年總存活率為72.34%顯著低于低表達(dá)患者5年的總存活率92.31%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.614，P=0.018)。見(jiàn)圖1。

3 討論

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的，發(fā)生部位為乳腺上皮組織，其主要臨床表現(xiàn)為乳腺腫塊、乳頭溢液、皮膚改變、乳頭乳暈異常及腋窩淋巴結(jié)腫等[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌約99%患者為女性，約1%患者為男性，我國(guó)乳腺癌患者占全球乳腺癌女性患者的23%，略小于發(fā)達(dá)國(guó)家的27%[7]，近年來(lái)我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)不斷增加，且有年輕化的趨勢(shì)，已成為威脅女性健康的第一大殺手，因此乳腺癌的防治研究已成為我國(guó)惡性腫瘤防治研究的重要任務(wù)[8]。然而乳腺癌的病因至今尚未完全清楚，研究表明，25歲以上女性、乳腺癌家族史、乳腺腺體致密、月經(jīng)初潮早、絕經(jīng)遲、未婚、未育、晚育、未哺乳、長(zhǎng)期服用外源性雌激素長(zhǎng)期過(guò)量飲酒等因素是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素[9]。通過(guò)基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制與原癌基因、抑癌基因及相關(guān)編碼蛋白質(zhì)的改變有關(guān)，端粒酶激活原癌基因及抑癌基因失活可能引發(fā)一系列復(fù)雜的多基因、多階段協(xié)同作用的過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[10]。因此，通過(guò)研究分析乳腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物不僅可以研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，還可以對(duì)其預(yù)后情況作出判斷，從而采取一定的治療措施，提高患者生活質(zhì)量，降低患者病死率。

表3 SNHG12與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表4 影響預(yù)后因素Cox回歸分析

圖1miR-155-5p、ELK3表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼能力，lncRNA異常表達(dá)參與多種生物調(diào)節(jié)過(guò)程，如胚胎發(fā)生、干細(xì)胞多功能性、細(xì)胞生長(zhǎng)和惡性腫瘤發(fā)生。lncRNA表達(dá)水平可能與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)，可能作為腫瘤疾病的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[11]。lncRNA SNHG12是一種被鑒定為在腫瘤患者中表達(dá)上調(diào)的新型lncRNA，在癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。Wang等[12]研究表明結(jié)直腸癌組織中SNHG12表達(dá)上調(diào)，且lncRNA SNHG12可促進(jìn)結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的增殖，抑制癌細(xì)胞的凋亡，可能是一種有用的生物標(biāo)志物。Ding等[13]研究表明乳頭狀甲狀腺癌患者癌組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG12表達(dá)上調(diào)，且lncRNA SNHG12表達(dá)水平能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG12表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示lncRNA SNHG12可能與乳腺癌疾病的發(fā)生有關(guān)?？赡苁且环N潛在的生物標(biāo)志物。

目前已知影響乳腺癌患者治療療效預(yù)測(cè)及預(yù)后的影響因素主要有病理學(xué)和生物學(xué)因素兩類，臨床病理學(xué)因素有年齡、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等[14]。生物學(xué)因素指標(biāo)有ER、PR及Her2的狀態(tài)等。Zhang等[15]研究表明lncRNA SNHG12在胃癌患者癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，SNHG12高表達(dá)患者存活期短，提示lncRNA SNHG12可能是胃癌患者預(yù)后的新的潛在生物標(biāo)志物。Wang等[16]研究表明三陰性乳腺癌的lncRNA表達(dá)譜中，lncRNA SNHG12表達(dá)量顯著上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤直徑與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG12表達(dá)情況與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER有關(guān)，提示lncRNA SNHG12表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床特征有關(guān)，其表達(dá)上調(diào)可能提示不良預(yù)后。本研究術(shù)后隨訪5年結(jié)果顯示，共有15例患者死亡，其中l(wèi)ncRNA SNHG12高表達(dá)乳腺癌患者5年總存活率為72.34%，顯著低于低表達(dá)患者5年總存活率92.31%，提示lncRNA SNHG12高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，可能作為乳腺癌預(yù)后的良好指標(biāo)。本研究進(jìn)一步通過(guò)Cox模型多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA SNHG12是影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示lncRNA SNHG12可能對(duì)評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后具有重要價(jià)值。

綜上所述，乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG12表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與患者的腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有較大關(guān)系，提示lncRNA SNHG12表達(dá)水平對(duì)評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后可能具有重要的參考價(jià)值，可能成為乳腺癌患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。然而本研究的樣本數(shù)量較少，下一步準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本繼續(xù)進(jìn)行深入的研究，以期為乳腺癌的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。