miR-146a和VEGF在視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞伴發(fā)黃斑水腫患者房水中的表達(dá)及意義

郭清 張貴森 張寶東

視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)是較為常見的第二大視網(wǎng)膜血管病變疾病，其主要特征表現(xiàn)為視網(wǎng)膜水腫、出血，視網(wǎng)膜血液瘀滯、靜脈迂曲擴(kuò)張[1]。CRVO發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，為多因素致病，常與其他眼部疾病、心血管疾病相關(guān)。CRVO往往導(dǎo)致黃斑水腫，進(jìn)而引起患者中心視力下降，嚴(yán)重影響患者生活[2]。因此CRVO伴發(fā)黃斑水腫也受到醫(yī)學(xué)界的重視。有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在疾病的發(fā)展過程中具有重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF促進(jìn)患者眼部血管新生，血管滲透，目前常使用抗VEGF藥物治療CRVO伴發(fā)黃斑水腫[4]。隨著對疾病的研究深入到基因?qū)用妫l(fā)現(xiàn)miR-146a在糖尿病視網(wǎng)膜病變中具有重要作用[5]。但miR-146a在CRVO伴發(fā)黃斑水腫中的研究筆者所見鮮有報道，故本研究探討CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者房水中miR-146a與VEGF的表達(dá)，并分析其相關(guān)性和表達(dá)意義，為臨床診治提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2018年8月在我院就診的112例CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者(研究組)，男52例，女60例；年齡30～65歲，平均年齡(51.18±5.37)歲；病程1周～13個月。另選取同期60例無眼部疾病的白內(nèi)障患者為對照組，男26例，女34例；年齡30～67歲，平均年齡(50.37±5.61)歲。2組性別比、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過相干光斷層成像(OCT)、熒光素眼底血管造影(FFA)檢查明確診斷為CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者；②既往未使用抗VEGF藥物治療；③無其他眼部手術(shù)史；④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有高眼壓患者；②眼部活動性炎癥患者；③妊娠期和哺乳期患者；④患有全身其他系統(tǒng)性疾病，影響房水中細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.3 方法

1.3.1 一般檢查:患者入院后接受全面的眼科檢查?；颊呓?jīng)FFA、OCT(德國，Carl-Zeiss Medite公司)、眼底彩照進(jìn)行確診，另外進(jìn)行驗光、眼內(nèi)壓(IOP)、最佳矯正視力、眼部B超、裂隙燈檢查，所有研究對象進(jìn)行包括血常規(guī)、血壓、血糖、心率等的基本檢查，評價患者是否耐受玻璃體腔用藥。

1.3.2 房水采集:患者按照內(nèi)眼手術(shù)規(guī)范進(jìn)行消毒，用鹽酸奧布卡因滴眼液麻醉患眼，采用1 ml 注射器針頭于角膜穿刺入前房緩慢抽取房水0.1～0.5 ml，撤針后角膜穿刺口自閉。收集房水于不含熱源和內(nèi)毒素的離心管中，15 000 r/min 離心10 min，避光保存于-70℃冰箱中。收集房水后使用開瞼器開瞼，結(jié)膜囊內(nèi)消毒，于顳上方角膜緣處3.5～4.0 mm進(jìn)行玻璃體腔注藥(雷珠單抗0.05 ml/0.5 mg)，注射結(jié)束后結(jié)膜囊內(nèi)涂抗生素眼膏。

1.3.3 qRT-PCR檢測miR-146a與VEGF表達(dá)水平:取凍存的房水標(biāo)本按照Trizol試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以相對應(yīng)的cDNA為模板對miR-146a、VEGF進(jìn)行qRT-PCR檢測。反應(yīng)體系為25 μl：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl。反應(yīng)程序為：95℃ 10 min；95℃ 15 s；48℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物均由上海生工公司合成。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行Ct值分析，以GADPH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計算miR-146a、VEGF的相對表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 TNF-α、IL-6、VEGF水平檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測患者房水中TNF-α、IL-6、VEGF水平，試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 2組患者臨床資料比較 2組患者年齡、性別比、高血壓比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，研究組TNF-α、IL-6、VEGF水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 2組患者房水中miR-146a、VEGF mRNA的表達(dá)水平比較 qRT-PCR檢測房水中miR-146a、VEGF mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示研究組中miR-146a(1.03±0.21)表達(dá)水平顯著低于對照組中miR-146a(7.93±1.51)水平，研究組中VEGF mRNA(3.45±1.02)表達(dá)水平顯著高于對照組VEGF mRNA(1.02±0.23)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 2組患者臨床資料比較

組別miR-146aVEGF mRNA研究組(n=112)1.03±0.21?3.45±1.02?對照組(n=30)7.93±1.511.02±0.23

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 患者房水中miR-146a與VEGF的相關(guān)性 對患者房水中miR-146a與VEGF進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，顯示miR-146a與VEGF呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.659，P=0.001)，VEGF隨miR-146a水平的降低而升高。見圖2。

2.4 影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫的多因素分析 將CRVO伴發(fā)黃斑水腫病情為因變量，以年齡、TNF-α、IL-6、miR-146a與VEGF為自變量并進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示TNF-α、IL-6與VEGF水平均是影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫病情的危險因素，miR-146a是CRVO伴發(fā)黃斑水腫病情的保護(hù)因素，該病情與年齡無關(guān)。見表4。

圖2 miR-146a與VEGF相關(guān)性分析

表4 影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫病情的多因素分析

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞是常見的眼底血管疾病，根據(jù)阻塞部位不同可分為中央靜脈阻塞和分支靜脈阻塞。CRVO的病因與視網(wǎng)膜炎癥、高血壓、血流動力學(xué)、動脈硬化疾病等具有密切聯(lián)系[6]。目前對于CRVO伴發(fā)黃斑水腫的治療主要是玻璃體腔注射雷珠單抗、曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)、抗VEGF的藥物等，但是TA雖然短期內(nèi)效果良好，但是隨著體內(nèi)藥物濃度的減少，水腫會繼續(xù)出現(xiàn)，需要再次治療。部分藥物對疾病的治療不徹底，且容易引起患者眼壓升高，眼內(nèi)炎癥等不良反應(yīng)，抗VEGF的藥物的效果卻更加良好，所以VEGF在CRVO伴發(fā)黃斑水腫中的表達(dá)和意義有待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA與多種疾病的發(fā)展具有密切聯(lián)系[3-6]，研究報道，miR-146a可調(diào)控機(jī)體的炎性反應(yīng)和細(xì)胞重構(gòu)[7]。目前關(guān)于VEGF、miR-146a在CRVO伴發(fā)黃斑水腫中的報道筆者所見較少，本研究探討VEGF、miR-146a在CRVO伴發(fā)黃斑水腫中的表達(dá)意義及關(guān)系，為治療CRVO伴發(fā)黃斑水腫靶點治療提供理論基礎(chǔ)。

VEGF廣泛存在于機(jī)體多種組織中，在眼部處于正常無疾病狀態(tài)時視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及周細(xì)胞中均表達(dá)較低，其在眼部的低表達(dá)維持眼部正常[8]。缺氧狀態(tài)時視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的VEGF，VEGF引起肌動蛋白纖維重構(gòu)及通透性增加[9]。VEGF過表達(dá)引起血管的通透性增加、促進(jìn)新生血管的形成造成眼內(nèi)壓升高，導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血、滲出、水腫，造成黃斑水腫[10]。有研究報道，CRVO患者房水、玻璃體腔中VEGF表達(dá)水平上調(diào)，其可能破壞了血-視網(wǎng)膜屏障[11]。IL-6可通過改變內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)而引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加[12]。巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞在機(jī)體缺血、缺氧狀態(tài)下可刺激白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6[13,14]。本研究通過qRT-PCR檢測房水中VEGF mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示研究組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，說明VEGF在CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者中高表達(dá)，其促進(jìn)血管生成，引起黃斑水腫。本研究對房水中IL-6、VEGF水平進(jìn)行ELISA檢測，檢測結(jié)果顯示IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)，表明IL-6可能在CRVO伴發(fā)黃斑水腫中發(fā)揮重要作用，且ELISA檢測發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白水平與檢測 mRNA水平相一致，均顯著高于對照組。Logistic多因素分析顯示，VEGF、IL-6均是影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫的危險因素，表明VEGF、IL-6均在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有促進(jìn)意義。

miRNA種類繁多，且多種mi RNA在機(jī)體的生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。miR-146a與腫瘤、人體的衰老具有密切聯(lián)系，研究表明miR-146a可以下調(diào)癌細(xì)胞中的VEGF的表達(dá)[15,16]。研究表明miR-146a在老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)中表達(dá)較低，其受到TNF-α的誘導(dǎo)負(fù)調(diào)控IL-6的表達(dá)[17]。APRE-19細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a可以抑制VEGF的表達(dá)，表明在AMD中miR-146a可能通過抑制VEGF的表達(dá)發(fā)揮其生物功能[18]。TNF-α可提高血管內(nèi)皮生長因子、VEGF等的反應(yīng)性[19]。TNF-α由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其刺激多種黏附因子、炎性因子的產(chǎn)生，引起血管及組織損傷[20]。本研究通過qRT-PCR檢測房水中miR-146a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示研究組miR-146a mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)，Pearson相關(guān)性分析顯示miR-146a與VEGF呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.659,P=0.001)，說明miR-146a在CRVO伴發(fā)黃斑水腫患者中低表達(dá)，可能miR-146a對VEGF的抑制作用減弱，造成VEGF表達(dá)水平升高，造成黃斑水腫。本研究對房水中TNF-α水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示TNF-α水平顯著高于對照組(P<0.05)，表明TNF-α可能在CRVO伴發(fā)黃斑水腫中發(fā)揮重要作用，其可能是刺激炎性因子的產(chǎn)生促進(jìn)眼部炎性反應(yīng)、促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生，引起血管增多。Logistic多因素分析顯示，TNF-α是影響CRVO伴發(fā)黃斑水腫的危險因素，miR-146a是疾病發(fā)展的保護(hù)因素，表明miR-146a可能對疾病具有抑制作用，可為疾病的治療提供靶點。

綜上所述，CRVO伴發(fā)黃斑水腫中miR-146a、VEGF表達(dá)水平相關(guān)，疾病發(fā)生、發(fā)展過程中可能是miR-146a對VEGF的抑制作用減弱，可為提高CRVO伴發(fā)黃斑水腫的診療效果提供新的研究思路。