尋常型銀屑病患者中Th17細胞、CD4+、CD25+調節(jié)性T細胞表達水平及意義

廖曉容 黃慧

尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)又稱為牛皮癬，為臨床一種常見的皮膚病，易復發(fā)。進行期、靜止期和退行期為PV的3個時期[1]。約粟粒至綠豆大小的紅色炎性丘疹為該病首先表現(xiàn)，棕紅色斑塊為融合擴大逐漸形成，清楚邊界，炎性紅暈周圍，明顯浸潤基底及多層干燥的銀白色或灰白色鱗屑覆蓋表面為PV之后的臨床表現(xiàn)。銀屑病三聯(lián)征為臨床診斷該病的主要特征，分別為點狀出血、白色鱗屑和發(fā)亮薄膜。點狀出血現(xiàn)象為薄膜刮除，小出血點出現(xiàn)；薄膜現(xiàn)象為表面鱗屑被輕輕刮除，一層淡紅色發(fā)亮的半透明薄膜逐漸露出[2-4]。目前，PV的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明和明確，且被活化的效應性T細胞功能紊亂發(fā)生機制也未明確。CD4+T細胞的2個新亞型為Treg細胞，即CD4+CD25+調節(jié)性T細胞為近年來研究的重要課題，Th17細胞也被越來越多研究報道。諸多研究報道，自身免疫性疾病多與Treg細胞和Th17細胞息息相關，但關于PV患者外周血中Th17 細胞、Foxp3+Treg 細胞及Treg細胞的表達水平的研究報道較少[5，6]。本研究主要采用流氏細胞儀直接免疫熒光法分析和研究PV患者中Th17細胞、CD4+、CD25+調節(jié)性T細胞表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月至2018年6月重慶市第六人民醫(yī)院皮膚科收治的64例PV患者為PV組，另選取同期健康體檢者40例為健康對照組。PV組中，男34例，女30例；年齡20～60歲，平均年齡(36.20±16.60)歲；PV患者的嚴重程度和皮損面積指數(shù)(PASI)按PASI評分為7.50～22.4分，平均評分(13.40±3.75)分，其中PASI≤25分為輕度，PASI>25分為重度；病程9 d～20年，平均病程(10.10±5.89)年。經(jīng)臨床相關檢查或其他如組織病理學檢查等確診為PV，且符合相關臨床診斷標準；PV患者典型臨床表現(xiàn)為紅色炎性丘疹、銀白色鱗屑和紅斑皮疹等；1個月內免疫抑制劑或糖皮質激素尚未使用；既往無銀屑病等皮膚病史。健康對照組中，男28例，女12例；年齡19～66歲，平均年齡(38.49±14.16)歲。1個月內未發(fā)生真菌、細菌或病毒感染。2組性別比和年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 試劑與儀器 (1)儀器：采用流式細胞儀(由美國BD公司購入)。(2)試劑：人調節(jié)性T細胞熒光抗體標記試劑盒，包括同型對照抗體PE-Cy5 Rat IgG2aFITC抗人CD4、Fixation/Permeabilization、PE-Cy5抗人Foxp3、PE抗人CD25和刺激劑Cell Stimulation Cocktaul(由ebioscience公司購入)；人淋巴細胞分離液(由TBD公司購入)；破膜劑FIX&PERM Kit(由Multi Sciences公司購入)；FITC抗人CD3抗體、PerCP抗人CD8a、PE抗人IL-17A 抗體和同型對照(由BioLegend 公司購入)；RP-MI1640培養(yǎng)液(由Gibco公司購入)、小牛血清(由四季青購入)。

1.3 檢測方法

1.3.1 CD4+CD25+T細胞:采用肝素抗凝2 ml靜脈血，20 μl抗CD4-FITC、100 μl全血和20 μl抗CD25-APC標記抗體和20 μl mouse γ1 APC、100 μl全血和20 μl mouseγ1 FITC分別于2支試管中。室溫避光，時間為20 min，溶血素2 ml加入，室溫避光，時間為10 min，1 000 r/min，離心棄上清，2 ml磷酸鹽緩沖液加入，1 000 r/min，離心棄上清，PBS，1 000 r/min，離心棄上清，500 μl 1%多聚甲醛固定加入，采用流式細胞儀檢測。

1.3.2 Foxp3+T細胞:采用肝素抗凝3 ml靜脈血，外周血單個核細胞分離采用密度梯度離心法，分別加入20 μl抗CD4-FITC、mouse γ1 FITC、抗CD25-APC、mouse γ1 APC于1×106個細胞中，混勻，避光孵育，時間為30 min，1 ml破膜劑加入，避光孵育，時間為45 min，20 μl rat IgG2a PE和抗Foxp3-PE加入，避光孵育，時間為30 min，洗滌，采用流式細胞儀檢測。

1.3.3 細胞因子IL-10、TGF-β1:采用肝素抗凝10 ml靜脈血，外周血單個核細胞分離采用Ficoll淋巴細胞分層液的密度梯度離心法，于37℃和5% CO2RPMI 1640培養(yǎng)基中移入，20 ng/ml植物血凝素A加入。分別加入20 μl mouse γ1 FITC、抗CD4-PE、抗CD25-APC和mouse γ1APC于流式反應管中，混勻。1 ml破膜劑加入，避光孵育45 min，分別加入生物素化抗TGF-β1 抗體、抗 IL-10-FITC和親和素-FITC，于室溫避光，時間為20 min，PBS洗滌，重懸，采用流式細胞儀檢測。

1.3.4 Th17細胞:于24孔培養(yǎng)板內加入2×106/ml外周血單個核細胞懸液，1 ml/孔，刺激劑加入，于37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中5 h。細胞給予離心棄上清，500 μl 破膜劑加入，于4℃孵育，時間為15 min，離心棄上清，細胞收集分組，F(xiàn)ITC-CD320 μl、PerCP-CD8a Anti body 5 μl、PE-IL-17A 20 μl和PE-IgG 15 μl加入。PBS洗滌，于300 μl洗滌液重懸細胞中，采用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 健康對照組與PV患者進行期組和靜止期組CD4+CD25+Foxp3+T細胞及CD4+CD25+T細胞水平比較 健康對照組CD4+CD25+Foxp3+T細胞及CD4+CD25+T細胞水平明顯高于PV進行期患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；健康對照組CD4+CD25+Foxp3+T細胞及CD4+CD25+T細胞水平明顯高于PV靜止期患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

組別CD4+CD25+Foxp3+ T細胞CD4+CD25+T細胞健康對照組(n=40)6.02±1.95?4.94±1.36?進行期組(n=32) 4.54±1.103.84±0.88靜止期組(n=32) 5.25±1.374.30±1.25F值8.127.69P值<0.01<0.01

2.2 健康對照組與PV患者進行期組和靜止期組CD4+CD25+T細胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β細胞水平比較 健康對照組CD4+CD25+T細胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β細胞水平明顯高于PV進行期患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；健康對照組CD4+CD25+T細胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β細胞水平明顯高于PV靜止期患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 PV組和健康對照組Th17細胞水平比較 健康對照組Th17細胞水平明顯低于PV組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

組別CD4+CD25+T細胞 IL-10CD4+CD25+TGF-β健康對照組(n=40)16.34±9.97?4.82±1.83?進行期組(n=32) 11.56±5.632.64±0.96靜止期組(n=32) 14.48±8.254.22±1.54F值2.9518.99P值<0.01<0.01

組別Th17細胞PV組(n=64)2.19±0.77健康對照組(n=40)0.64±0.21 t值12.425 P值<0.01

2.4 CD4+CD25+Foxp3+T細胞和CD25+IL-10+T細胞及CD25+TGF-β+T細胞與疾病嚴重程度PASI的相關性 Pearson相關性分析可知，PASI與CD25+TGF-β+T細胞無相關性(P>0.05)；PASI 與CD4+CD25+Foxp3+T細胞和CD25+IL-10+T細胞呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 CD4+CD25+Foxp3+T細胞和CD25+IL-10+T細胞及CD25+TGF-β+T細胞與疾病嚴重程度PASI的相關性分析

2.5 Foxp3+Treg細胞、Treg細胞、Th17細胞與疾病嚴重程度PASI的相關性 Foxp3+Treg細胞和Treg細胞呈正相關(r= 0.563，P<0.05)，Treg細胞和Th17細胞呈負相關(r= -0.522，P<0.05)；Treg細胞和Th17細胞和PASI無相關性(r值分別為0.021、0.076，P>0.05)。

3 討論

臨床資料表明，PV患者重要病理特征之一為T淋巴細胞浸潤，其發(fā)病與Treg、Th17 細胞密切相關[7,8]。Treg細胞可使機體自身免疫耐受維持，因兼?zhèn)涿庖哒{節(jié)和免疫抑制作用；Th17細胞在機體炎性反應發(fā)揮重要作用，因Th17細胞為重要炎性細胞，釋放趨化因子和前炎性細胞因子可通過分泌IL-17誘導實現(xiàn)；調節(jié)性T細胞的一個重要標記和轉錄因子forkhead/winged helix家族的新成員為叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子即Foxp3，其在Treg細胞的分化與功能方面發(fā)揮重要作用，可參與其中，通過3種途徑實現(xiàn)，分別為對Foxp3 的轉錄水平進行特異性調控相互、 翻譯后修飾調控Foxp3蛋白和作用于其他轉錄因子。自身免疫疾病與Foxp3基因的突變息息相關[9-11]。

TGF-β和 IL-10為Tr細胞分泌的2個重要細胞因子[12，13]。TGF-β在細胞的分化中發(fā)揮重要作用，可誘導CD4+T細胞轉化為CD4+CD25+Foxp3+T細胞，TGF-β為多效性細胞因子，在骨的形成、骨的鈣化成、骨細胞分泌、合成、增殖和分化中發(fā)揮著重要促進作用，在骨的吸收方面發(fā)揮重要抑制作用[14]。Foxp3基因突變與PV進展和TGF-β異常改變密切關聯(lián)[15]。重要免疫負調節(jié)因子IL-10為B細胞活化因子和CTL分化因子，IL-2可通過IL-10被直接抑制。IL-10在巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生NO、輔助刺激分子和單核細胞表達MHC-1I類抗原、增殖Th17細胞、激活抗原特異性T細胞和前炎性細胞因子的產(chǎn)生方面發(fā)揮抑制作用。IL-2Rα鏈為CD25分子，效應細胞產(chǎn)生IL-2被被動地吸收為CD25+T 細胞介導抑制作用的一個重要機制。初始T細胞分化為Th17細胞可通過IL-6和TGF-β共同作用實現(xiàn)，銀屑病皮損處的炎性反應由于Th17細胞通過產(chǎn)生一系列促炎因子加重[16-18]。

外周血和皮損中健康正常人CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的功能和數(shù)目明顯高于PV患者，無缺陷的效應性T細胞的調節(jié)功能為健康正常人的表現(xiàn)，相反地，缺陷的效應性T細胞的調節(jié)功能為PV患者的表現(xiàn)[19,20]。本研究結果顯示，健康對照組CD4+CD25+Foxp3+T細胞及CD4+CD25+T細胞水平明顯高于PV進行期患者；健康對照組CD4+CD25+Foxp3+T細胞及CD4+CD25+T細胞水平明顯高于PV靜止期患者；健康對照組CD4+CD25+T細胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β的細胞水平明顯高于PV進行期患者；健康對照組CD4+CD25+T細胞IL-10和CD4+CD25+TGF-β的細胞水平明顯高于PV靜止期患者；健康對照組Th17細胞水平明顯低于PV組；經(jīng)Pearson相關性分析可知，PASI與CD25+TGF-β+T細胞無相關性；PASI 與CD4+CD25+Foxp3+T細胞和CD25+IL-10+T細胞呈負相關；Foxp3+Treg細胞和Treg細胞呈正相關，Treg細胞和Th17細胞呈負相關；Treg細胞和Th17細胞和PASI無相關性。提示下降的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞、Foxp3、IL-10和TGF-β的和上升的Th17細胞為PV病情發(fā)展的重要影響因素，即缺失的免疫功能和調節(jié)性T細胞數(shù)量的減少介導PV的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，PV病情發(fā)展與CD4+CD25+調節(jié)性T細胞、Foxp3、IL-10和TGF-β的表達下降和Th17細胞表達上升有關。