結(jié)直腸癌患者血清miR-542-3p和miR-203水平及臨床意義

岑小寧 黃許森 韋維 黃海舸 蘭海生

結(jié)直腸癌是我國(guó)成人常見的惡性腫瘤，每年新增約40萬(wàn)病例，略高于發(fā)達(dá)國(guó)家(3%～4%)，嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的健康和生命[1]。目前結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制尚未明確，普遍認(rèn)為與年齡、生活習(xí)慣、體內(nèi)激素變化和環(huán)境等因素有關(guān)[1,2]。由于結(jié)直腸生理位置特殊，早期癌變不易診斷，而早期診斷對(duì)癌癥的有效治療具有重要意義，因此深入探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)結(jié)直腸癌患者的早期診斷、治療以及提高結(jié)直腸癌患者的生存質(zhì)量具有重要臨床價(jià)值[3,4]。miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、凋亡也有著密切的聯(lián)系，miR-542-3p通過各種多功能蛋白、生長(zhǎng)因子信號(hào)、受體分子等參與細(xì)胞內(nèi)周期進(jìn)程的調(diào)控，并對(duì)細(xì)胞 DNA 的復(fù)制起始和增殖起到十分重要的作用[5]。miR-542-3p可通過抑制蛋白激酶 B信號(hào)通路進(jìn)而抑制腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和集落形成。miR-203對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)控、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[6]。研究證實(shí)，miR-203基因突變時(shí)，表達(dá)降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞無限制増殖、血管生成速度加快，且相關(guān)細(xì)胞因子如VEGF、P53等均表達(dá)增高[6]。因此本研究探討結(jié)直腸癌患者血清miR-542-3p和miR-203水平與臨床病理特征的相關(guān)性，為結(jié)直腸癌患者的早期診斷、治療提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2018年9月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的結(jié)直腸癌患者134例為觀察組，其中男82例，女52例；年齡47～68歲，平均年齡(57.5±10.8)歲；病程6個(gè)月～11年，平均病程(5.36±2.14)年。符合美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCN CRC診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，手術(shù)切除標(biāo)本后行病理檢查以判定腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目、病理學(xué)分級(jí)、TNM分期、有無淋巴血管間隙浸潤(rùn)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。選擇同期正常體檢者118例為對(duì)照組，其中男71例，女47例；年齡46～69歲，平均年齡(57.1±11.2)歲。結(jié)直腸癌患者及正常體檢者自愿提供血清，用作分析血清miR-542-3p和miR-203表達(dá)水平。2組在性別比、年齡、等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①腸鏡下見腫瘤形態(tài)為潰瘍型或隆起型，病理結(jié)果為中、低、未分化腺癌或黏液腺癌；②所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①正在接受放化療治療的結(jié)直腸癌患者或患其他惡性腫瘤患者；②肝、腎、心功能異常者。

1.3 儀器與試劑 Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)，miR-542-3p和miR-203mRNA的表達(dá)測(cè)定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)，貝克曼庫(kù)爾特ACCESS2化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套癌胚抗原定量測(cè)定試劑盒。

1.4 miR-542-3p和miR-203水平測(cè)定 結(jié)直腸癌患者于根治術(shù)前及術(shù)后3～4周采集全血，健康體檢者體檢時(shí)采血，2組皆清晨空腹肱靜脈抽血，置于10 ml無菌采血管中，室溫靜置30 min,4 500 r/min，離心10 min，分離血清，-70℃凍存?zhèn)溆?，測(cè)定miR-542-3p和miR-203 mRNA 濃度和純度，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測(cè)其表達(dá)量。見表1、2。

表1 miR-542-3p、miR-203引物序列

表2 RT-PCR反應(yīng)體系

1.5 血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平的測(cè)定 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)定結(jié)直腸癌患者及健康體檢者血清中CEA表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和觀察組術(shù)前血清miR-542-3p、miR-203、CEA水平表達(dá) 觀察組術(shù)前miR-542-3p、miR-203水平低于對(duì)照組，CEA水平高于對(duì)照組(t值分別為26.682、15.932、31.136，P<0.05)。見表3。

組別miR-542-3p mRNAmiR-203mRNACEA(ng/ml)對(duì)照組(n=118) 3.48±0.153.15±0.172.54±0.56觀察組術(shù)前(n=134)1.78±0.72?1.95±0.86?12.78±3.76?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 觀察組術(shù)前、術(shù)后血清miR-542-3p、miR-203、CEA水平表達(dá) 觀察組術(shù)后miR-542-3p、miR-203水平高于術(shù)前，CEA水平低于術(shù)前(t值分別為14.023、9.372、23.049，P<0.05)。見表4。

時(shí)間miR-542-3p mRNAmiR-203mRNACEA(ng/ml)術(shù)前1.78±0.721.95±0.8612.78±3.76術(shù)后2.98±0.68?2.89±0.78?4.77±1.43?

注：與術(shù)前比較，*P<0.05

2.3 不同臨床特征中血清miR-542-3p、miR-203水平比較 不同年齡、腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目特征組中血清miR-542-3p、miR-203水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為0.138、1.200、0.068、0.172、0.069、0.055，P>0.05)；而病理學(xué)分級(jí)越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，血清miR-542-3p、miR-203表達(dá)水平越低(t值分別為15.826、10.333、12.068、9.953、8.237、8.840、8.070、12.065、5.250、13.222，P<0.05)。見表5。

項(xiàng)目miR-542-3p t值P值miR-203 mRNAt值P值年齡(歲) <50(n=34)1.74±0.750.138>0.051.97±0.880.172>0.05 ≥50(n=100)1.76±0.721.94±0.83腫瘤最大徑(cm) ≥5(n=84)1.82±0.711.200>0.052.00±0.800.069>0.05 <5(n=50)1.79±0.782.01±0.82腫瘤數(shù)目 單發(fā)(n=45)1.75±0.830.068>0.051.89±0.990.055>0.05 多發(fā)(n=89)1.72±0.731.90±0.98病理學(xué)分級(jí) 低、中分化(n=85)2.20±0.3115.826<0.052.54±0.268.840<0.05 高分化(n=49)1.32±0.311.67±0.66TNM分期 Ⅰ～Ⅱ(n=70)2.30±0.2110.333<0.052.63±0.208.070<0.05 Ⅲ～Ⅳ(n=64)1.58±0.521.81±0.79淋巴血管間隙浸潤(rùn) 無(n=52)2.17±0.3312.068<0.052.39±0.4112.065<0.05 有(n=82)1.40±0.401.47±0.46淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(n=90)2.40±0.129.953<0.052.08±0.735.250<0.05 有(n=44)1.58±0.541.52±0.49復(fù)發(fā) 無(n=72)1.98±0.528.237<0.052.37±0.4213.222<0.05 有(n=62)1.38±0.311.41±0.42

2.4 CEA與miR-542-3p、miR-203相關(guān)性分析 CEA與miR-542-3p、miR-203呈負(fù)相關(guān)(r=-0.569、-0.613，P<0.05)。見表6。

表6 CEA與miR-542-3p、miR-203相關(guān)性分析

2.5 ROC曲線及靈敏度、特異度分析 受試者工作特征曲線提示，CEA、miR-542-3p、miR-203ROC曲線下面積(AUC)分別為0.753(95%CI 0.602～0.798)，0.680(95%CI 0.523～0.745)，0.658(95%CI 0.569～0.779)，miR-542-3p、miR-203兩者的AUC相近，皆低于CEA，miR-542-3p、miR-203診斷結(jié)直腸癌的靈敏度、特異度相近(χ2=2.142、1.978，P>0.05)，皆低于CEA(χ2=8.986、10.541，P<0.05)。見表7，圖1。

表7 ROC曲線及靈敏度、特異度分析

3 討論

我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年遞增，好發(fā)于30～60歲的成人，發(fā)病率為7.8%，在惡性腫瘤排名第四位，1994至2002年，結(jié)直腸癌發(fā)病率的增長(zhǎng)率為7.9%[8]。在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌成為危害人類健康排名第三的腫瘤，略低于肺癌，2014年，全球結(jié)直腸癌患者占所有惡性腫瘤15%，2015年高達(dá)27%，其病死率為25.03/10萬(wàn)，占惡性腫瘤死亡病例的14.56%，2012年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例超過200萬(wàn)，標(biāo)化發(fā)病率為37.68/10萬(wàn)，標(biāo)化死亡率為15.54/10萬(wàn)[9]。

miR-542-3p在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演者重要的角色。研究表明，miR-542-3p對(duì)抑制細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用，并能強(qiáng)烈促進(jìn)細(xì)胞凋亡，高度表達(dá)miR-542-3p的乳腺癌細(xì)胞株增殖能力低于高于野生株。低表達(dá)miR-542-3p蛋白的腫瘤細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞的能力強(qiáng)，而腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密結(jié)，才能穿過細(xì)胞外基質(zhì)層,建立轉(zhuǎn)移灶[10,11]。本研究中，觀察組miR-542-3p水平低于對(duì)照組，且術(shù)后觀察組miR-542-3p水平高于術(shù)前觀察組，與CEA負(fù)相關(guān)，這與上述結(jié)論一致。miR-542-3p在人胚胎組織中廣泛表達(dá)，在正常的甲狀腺表達(dá)正常，甲狀腺癌患者miR-542-3p蛋白表達(dá)異常降低，而隨著甲狀腺癌患者TMN分期的進(jìn)展，miR-542-3p表達(dá)逐漸降低，本研究中，病理學(xué)分級(jí)越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，血清miR-542-3p表達(dá)越低，也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p蛋白對(duì)于腦膜瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，其具有時(shí)間、空間表達(dá)特異性，若藥物激活miR-542-3p蛋白表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)得到有效抑制，miR-542-3p可能成為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[12]。

miR-203在Hedgehog信號(hào)通路扮演著核心調(diào)節(jié)作用，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結(jié)合時(shí)，Ptch抑制跨膜蛋白受體(Smo)的活化，Smo被釋放，其下游細(xì)胞因子miR-203被活化，促進(jìn)miR-203移位到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而抑制下游原癌基因[13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組miR-203水平低于對(duì)照組，且術(shù)后觀察組miR-203水平高于術(shù)前觀察組，與CEA呈負(fù)相關(guān)，與上述結(jié)論一致。miR-203具有強(qiáng)烈的抑制血管生成作用，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖和遷移：腫瘤細(xì)胞中一些血管活性因子(MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-8)與miR-203表達(dá)負(fù)相關(guān)。此外本研究發(fā)現(xiàn)，病理學(xué)分級(jí)越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，血清miR-203表達(dá)越低，說明miR-203具有抑制癌細(xì)胞分化與侵襲遷移能力的作用，結(jié)合近期研究，IL-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)由可能由miR-203調(diào)控，低表達(dá)miR-203的腫瘤細(xì)胞可促進(jìn)IL-8、血管及VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在供應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的血管系統(tǒng)的形成及實(shí)體腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14,15]。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，miR-542-3p、miR-203在診斷結(jié)直腸癌的靈敏度、特異度相近，miR-542-3p、miR-203具有較高的靈敏度、特異度，可作為診斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)志物，值得在臨床上推廣應(yīng)用。

綜上所述，miR-542-3p、miR-203在結(jié)直腸癌患者血清的表達(dá)量降低，miR-542-3p、miR-203在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起抑制作用；miR-542-3p、miR-203具有較高的靈敏度、特異度，可作為診斷結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)志物，值得在臨床上推廣應(yīng)用。