HBV感染通過上調(diào)MALAT1誘導(dǎo)AMPKα活化和巨噬細(xì)胞凋亡的功能與機(jī)制研究

饒兵

乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝型DNA病毒，可導(dǎo)致肝臟纖維化、肝硬化、慢性乙型肝炎、甚至發(fā)展成為肝細(xì)胞癌。目前，全球感染HBV的患者約有2.4億人，呈現(xiàn)全球流行疾病，而每年HBV致死人數(shù)達(dá)到65萬[1]。在中國慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者人數(shù)達(dá)到了2 000萬[2]。到目前為止，已明確HBV免疫功能低下是誘發(fā)CHB的主要病理基礎(chǔ)。慢性HBV感染的慢性肝臟炎癥及相關(guān)病理表現(xiàn)為多種白細(xì)胞浸潤，包括活化的巨噬細(xì)胞。HBV能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化和M2極化[3,4]。巨噬細(xì)胞是細(xì)胞凋亡的主要清除者，然而多種免疫紊亂都可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞自身的異常凋亡，已明確HBV感染激活異常免疫反應(yīng)從而損傷肝組織的同時(shí)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞成為免疫活性細(xì)胞的靶細(xì)胞或誘發(fā)自身凋亡導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步耗竭[5,6]。然而，HBV感染和巨噬細(xì)胞的凋亡之間的內(nèi)在機(jī)制仍不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的激活參與調(diào)控多種細(xì)胞凋亡的促進(jìn)[7]，AMPKα是AMPK的5’端的催化亞基，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最廣泛表達(dá)的AMPK亞型之一[8]。研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK可以抑制氧化低密度脂蛋白低密度脂蛋白(oxidised low-density lipoprotein，OX-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖，而且1 mmol/L的AMPK激活劑AICAR 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡[9]。但是，到目前為止仍不清楚AMPK信號的激活是否參與HBV感染導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞凋亡。MALAT1是一段廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的保守長鏈非編碼RNA序列，已被證實(shí)在選擇性剪接和基因表達(dá)等表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10]。MALAT1與多種病理過程密切相關(guān)，包括癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞的增殖和凋亡等[11]。研究發(fā)現(xiàn)HBx在HCC組織可誘導(dǎo)MALAT1的表達(dá)[12]，而且已發(fā)現(xiàn)MALAT1的高表達(dá)可能和AMPK的激活密切相關(guān)[13]。因此，推測MALAT1高表達(dá)和AMPK激活在HBV介導(dǎo)的巨噬凋亡中可能扮演重要角色。本研究旨在探討MALAT1和AMPK激活在HBV感染后巨噬細(xì)胞凋亡的功能和機(jī)制，為乙肝疾病治療探索新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2015年10月至2016年10月于我院進(jìn)行體檢的HBV-DNA陽性者及HBV-DNA陰性者共130例外周血單核巨噬細(xì)胞，分析lncRNA-MALAT1的表達(dá)差異。本研究中涉及到的志愿者均簽訂知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與巨噬細(xì)胞誘導(dǎo) 人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞系購于中國科學(xué)院細(xì)胞保藏庫(中國，上海)，使用RPMI-1640(Abcam,Cambridge,MA)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco)以及1%的鏈霉素，在溫度為37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞濃度達(dá)到1.0×106/ml用于巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)。細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，于含100 ng/ml佛波酯(PMA)、0.3% BSA的無血清RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3 巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

1.3.1 為進(jìn)一步證實(shí)HBV感染對巨噬細(xì)胞中MALAT1水平和細(xì)胞功能的影響，在體外使用HBV-X蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx(pc-HBx)轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞。HBV-X蛋白的真核表達(dá)載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染參考楊益大等[14]的方法并使用Lipofectamine 2000(美國，英杰公司)進(jìn)行。細(xì)胞分組：①對照組：未處理的巨噬細(xì)胞；②pc-HBx組：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pc-HBx的巨噬細(xì)胞；③pc-HBx-NC組：pc-HBx轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的陰性對照組。

1.3.2 為研究MALAT1在HBV感染的巨噬細(xì)胞中的功能，我們沉默了MALAT1并聯(lián)合pc-HBx共轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞。使用HBV-X蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx(pc-HBx)以及MALAT1小干擾RNA(si-MALAT1)和陰性對照(si-MALAT1-NC)(上海，吉瑪)共同轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000(美國，英杰公司)和生產(chǎn)商說明書中提供的方法。細(xì)胞分組：①對照組：未處理誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞；②si-MALAT1-NC組：單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-MALAT1-NC的巨噬細(xì)胞；③si-MALAT1組：單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-MALAT1的巨噬細(xì)胞；④pc-HBx組：單獨(dú)轉(zhuǎn)染pc-HBx的巨噬細(xì)胞；⑤pc-HBx+si-MALAT1-NC組：共轉(zhuǎn)染pc-HBx和si-MALAT1-NC的巨噬細(xì)胞；⑥pc-HBx-NC+si-MALAT1組：共轉(zhuǎn)染pc-HBx和si-MALAT1的巨噬細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR) 對各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。cDNA特定RNA產(chǎn)物的產(chǎn)量檢測使用SYBR?Green Master Mix，GAPDH作為內(nèi)參對MALAT1的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。反應(yīng)體系(20 μl)：10 μl SYBR，2.0 ng模板cDNA，正反向引物濃度均為20 μmol/L，體積為0.8 μl，最終使用滅菌蒸餾水加至20 μl。PCR過程：40個(gè)循環(huán),94℃，1 min，54℃，1 min；聚合72℃，1 min；延伸 72℃，7 min。相對表達(dá)使用公式2-ΔΔCt計(jì)算。見表1。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞凋亡率使用細(xì)胞壞死ELISA檢測試劑盒(Roche Diagnostics,Penzberg,Germany)進(jìn)行檢測。將各組細(xì)胞進(jìn)行離心(4℃，12 000 r/min，10 min)，隨后棄掉上清液，隨后使用200 μl裂解緩沖液裂解30 min。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)板，添加青鏈霉素并混合Anti-DNA-POD 和Anti-histone-biotin進(jìn)行2 h的孵育。在405 nm檢測其吸光度值，參考波長為490 nm。

1.6 Caspase-3 活性檢測 使用caspase-3/CPP32熒光測定試劑盒(Biovision,Mountain View,CA,USA)檢測caspase-3的活性。根據(jù)試劑盒的說明對細(xì)胞進(jìn)行消化并懸浮，存于50 μl的冷凍細(xì)胞裂解緩沖液中孵育10 min。每個(gè)樣品均添加50 μl的2×反應(yīng)緩沖液，用1 mmol/L DEVD-AFC底物在37℃孵育2 h。Caspase-3的活性使用含有400 nm感光濾光片和505 nm 的發(fā)散濾光片的熒光酶標(biāo)儀(Gemini XS;Molecular Devices)。使用BCA試劑盒(中國，碧云天)檢測蛋白中的濃度。每個(gè)樣品的蛋白濃度均歸一化為Caspase-3的活性。

1.7 Western blot 使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞并獲得總蛋白，使用BCA 蛋白濃度試劑盒(上海，碧云天)評估蛋白濃度。使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳并且使用硝酸纖維膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)，上樣量為每孔50 μg。5% 脫脂牛奶或者BSA對載有蛋白質(zhì)的膜進(jìn)行室溫孵育1 h。隨后使用一抗(AMPKα，p-AMPKα，cleaved-caspase-3)(美國，Abcam)和β-Actin(圣克魯斯生物科技公司，美國)在4℃進(jìn)行過夜孵育。進(jìn)一步使用二抗(ZSGB-BIO,Beijing,China)室溫孵育進(jìn)行2 h。使用Ecl檢測系統(tǒng)(Pierce,Rockford,IL,USA)對蛋白條帶進(jìn)行顯色，蛋白的表達(dá)水平均使用β-Actin進(jìn)行歸一化處理。

2 結(jié)果

2.1 HBV-DNA陽性者外周血單核巨噬細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)增加 為明確HBV是否影響外周血單核巨噬細(xì)胞中的MALAT1的表達(dá)，使用RT-qPCR方法檢測HBV-DNA陽性和陰性患者外周血中MALAT1的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV-DNA陽性患者外周血單核巨噬細(xì)胞中MALAT1升高比例為82.54%(52/63),而HBV-DNA陰性患者外周血單核巨噬細(xì)胞中MALAT1升高比例為8.95%(6/67)。MALAT1在HBV-DNA陽性患者外周血單核巨噬細(xì)胞中升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

類別MALAT1HBV-1.00±0.05HBV+3.05±0.55?

注：與HBV-比較，*P<0.05；HBV+：HBV陽性外周血單核細(xì)胞，HBV-：HPV陰性外周血單核細(xì)胞

2.2 高表達(dá)HBV-X蛋白促進(jìn)MALAT1表達(dá) 使用THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，并在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)HBV-X蛋白。與對照組相比，pc-HBx組中HBV-X蛋白水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組相比，pc-HBx-NC組的HBV-X蛋白水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)差異檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MALAT1在pc-HBx組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組相比，MALAT1的水平在pc-Hbx-NC組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。MALAT1在HBV感染后巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高。見表2，圖1。

組別HBV-X蛋白相對水平MALAT1相對水平對照組 1.00±0.051.00±0.07pc-HBx-NC組1.01±0.021.02±0.06pc-HBx組 6.54±0.55?4.95±1.12?

注：與對照組比較，*P<0.05；pc-HBx：HBV-X蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx；pc-HBx-NC：pcDNA3.1(+)空載體作為陰性對照

圖1 高表達(dá)HBV-X蛋白對MALAT1蛋白表達(dá)的影響

2.3 高表達(dá)HBV-X蛋白促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和AMPKα活化 與對照組相比，pc-HBx組中cleaved-caspase-3水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組相比，pc-HBx-NC組的cleaved-caspase-3蛋白水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，凋亡率在pc-HBx組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組相比，凋亡率在pc-HBx-NC組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA陽性者的外周單核細(xì)胞中cleaved-caspase-3蛋白水平高于HBV-DNA陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，HBV感染后巨噬細(xì)胞的凋亡率升高。AMPKα信號通路參與多種細(xì)胞凋亡途徑，檢測AMPKα和p-AMPKα的表達(dá)，以評估AMPKα在HBV-X過表達(dá)細(xì)胞中的活化程度。與對照組比較，AMPKα和p-AMPKα在pc-HBx組中均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組比較，二者的表達(dá)水平在pc-HBx-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，HBV-DNA陽性者的外周單核細(xì)胞中p-AMPKα水平高于HBV-DNA陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HBV可誘導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和AMPKα活化。見表3、4，圖2、3。

組別Cell apoptosis(%)cleaved-caspase-3AMPKαp-AMPKα對照組 61.00±10.05 1.00±0.07 1.00±0.18 1.00±0.25pc-HBx-NC組 60.00±13.00 1.02±0.08 0.99±0.07 0.99±0.15pc-HBx組 78.50±10.10? 1.70±0.37? 3.85±0.22? 5.10±0.55?

注：與對照組比較，*P<0.05

類別cleaved-caspase-3p-AMPKαHBV- 1.00±0.04 1.00±0.08HBV+ 1.60±0.03? 1.90±0.11?

注：與HBV-比較，*P<0.05

圖2 巨噬細(xì)胞高表達(dá)HBx對AMPKα激活的影響

圖3 外周血單核細(xì)胞中cleaved-caspase-3和p-AMPKα蛋白水平變化

2.4 HBV感染通過上調(diào)MALAT1誘導(dǎo)AMPKα活化并促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡 為探究MALAT1高表達(dá)在HBV感染巨噬細(xì)胞致凋亡和誘導(dǎo)AMPKα活化中的作用，對巨噬細(xì)胞進(jìn)行HBV-X過表達(dá)和si-MALAT1沉默MALAT1共處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別與對照組比較，單獨(dú)si-MALAT1組和單獨(dú)si-MALAT1-NC組中巨噬細(xì)胞凋亡率和p-AMPKα的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與pc-HBx組相比，pc-HBx+si-MALAT1組中巨噬細(xì)胞凋亡率和p-AMPKα的表達(dá)水平變化均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pc-HBx組相比，pc-HBx+si-MALAT1-NC組中巨噬細(xì)胞凋亡率和p-AMPKα的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖4。

3 討論

本研究在體內(nèi)和體外探討乙肝病毒HBV感染對人巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵作用和機(jī)制，明確乙肝病毒HBV可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡及長鏈非編碼RNA MALAT1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，而且增加AMPKα的活化。研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1的上調(diào)是導(dǎo)致HBV感染巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡及AMPKα活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。

乙肝病毒X蛋白(HBx)由乙肝病毒HBVX基因編碼，是一種包含154個(gè)氨基酸殘基的多功能蛋白[15]。HBx蛋白是HBV病毒復(fù)制和擴(kuò)散所必需，且與乙型肝炎和HCC的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在HBx介導(dǎo)的HCC組織中MALAT1的表達(dá)和HBx蛋白成正比[12]。本研究發(fā)現(xiàn)MALAT1高表達(dá)出現(xiàn)在HBV-DNA陽性患者外周血單核細(xì)胞和HBx過表達(dá)的巨噬細(xì)胞中。表明MALAT1不僅在HBx相關(guān)的HCC中上調(diào)[12]，而且在HBV感染的早期外周單核巨噬細(xì)胞中同樣處于高水平。

組別p-AMPKαCell apoptosis(%)對照組 1.00±0.05 66.4± 4.2si-MALAT1-NC組 1.05±0.03 65.5±11.2si-MALAT1組 1.01±0.20 67.1± 5.1pc-HBx+si-MALAT1組 1.35±0.28? 58.2± 4.1?pc-HBx+si-MALAT1-NC組 1.88±0.19 79.8± 5.8pc-HBx組 1.81±0.03# 85.5± 6.5#

注：與對照組比較，*P<0.05；與pc-HBx+si-MALAT1組比較，#P<0.05;pc-HBx：HBV-X蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx；pc-HBx-NC：pcDNA3.1(+)空載體作為陰性對照；si-MALAT1：MALAT1小干擾RNA；si-MALAT1：NCMALAT1小干擾RNA的陰性對照

圖4巨噬細(xì)胞高表達(dá)HBx聯(lián)合沉默MALAT1對p-AMPKα蛋白表達(dá)的影響

HBV感染可導(dǎo)致慢性肝炎癥狀到導(dǎo)致肝損傷，機(jī)體免疫應(yīng)答在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HBV感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞成為靶細(xì)胞，不僅受到免疫活性細(xì)胞攻擊，而且誘發(fā)自身凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步耗竭，造成持續(xù)感染狀態(tài)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA陽性患者的外周血單核巨噬細(xì)胞中凋亡標(biāo)記物cleaved-csaspase-3明顯上調(diào)，另外HBx高表達(dá)的巨噬細(xì)胞凋亡率和cleaved-csaspase-3表達(dá)均增加。

MALAT1與多種病理過程密切相關(guān)，尤其是腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等[16-18]。Sallé-Lefort等[13]在缺氧環(huán)境下發(fā)現(xiàn)，CaMKK激活的AMPK可誘導(dǎo)MALAT1的啟動(dòng)子反式激活從而導(dǎo)致MALAT1的高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在HBx高表達(dá)刺激下MALAT1被明顯過表達(dá)，而且AMPK也被激活。因此我們探索了HBx高表達(dá)刺激下AMPKα的激活和MALAT1表達(dá)水平升高的關(guān)系。在HBx高表達(dá)和MALAT1沉默聯(lián)合作用下，AMPKα的激活效應(yīng)被部分抑制，更重要的是，HBx誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡增加同樣被MALAT1沉默所減弱，表明MALAT1參與調(diào)節(jié)HBx誘導(dǎo)的AMPKα激活和巨噬細(xì)胞凋亡，并且暗示MALAT1和AMPK信號之間可能存在相互激活的關(guān)系。在多種非腫瘤疾病中，MALAT1的沉默可以保護(hù)細(xì)胞免受損傷，并減緩細(xì)胞的非正常凋亡。人為抑制MALAT1可減少糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞凋亡[11]，此效應(yīng)在心肌梗死導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡中同樣被發(fā)現(xiàn)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞極化可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，沉默MALAT1可以抑制M2巨噬細(xì)胞極化，從而減緩內(nèi)皮細(xì)胞的異常凋亡[20]。因此，在HBx誘導(dǎo)下通過促進(jìn)MALAT1的高表達(dá)從而激活A(yù)MPKα并大致巨噬細(xì)胞凋亡增加。