LINC01133在宮頸癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義

張賢莉 占義霞

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居世界第二位，死亡率在女性惡性腫瘤中居世界第一位[1,2]。統(tǒng)計顯示2008年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例為53萬左右，2012年全球?qū)m頸癌死亡人數(shù)為27萬左右[3]。實(shí)體瘤的主要治療手段為手術(shù)切除，宮頸癌的手術(shù)治療主要用于宮頸癌早期患者，同時加以放化療輔助治療，而對于晚期侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)患者的治療效果不佳[4]，目前缺乏有效的治療方法，使得宮頸癌患者5年生存率僅有40%左右[5]，而宮頸癌的發(fā)病分子機(jī)制尚未完全闡明，在分子水平研究宮頸癌發(fā)病的關(guān)鍵分子，可能對治療宮頸癌提供新的方法。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄本，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6,7]。有報道LINC01133在肺癌、胃癌、肝癌等常見腫瘤中發(fā)揮異常[8-10]，且調(diào)控重要的生物學(xué)功能，可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要因子，Mao等[11]報道 LINC01133是預(yù)測宮頸鱗癌患者存活率低的15個高表達(dá)lncRNAs之一，在宮頸癌中的其他研究尚未見報道。本文研究LINC01133在宮頸癌組織中的表達(dá)水平及與患者臨床特征的關(guān)系，同時以宮頸癌細(xì)胞株HeLa為研究對象研究LINC01133在宮頸癌細(xì)胞中具體的生物學(xué)功能及作用機(jī)制，旨在為宮頸癌分子靶向藥物的發(fā)掘提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年12月至2017年12月入住我院行手術(shù)治療的宮頸癌患者標(biāo)本，要求患者未合并其他腫瘤或具有生命威脅的疾病，術(shù)前未進(jìn)行放化療、靶向治療等抗腫瘤治療，并且具有完整的病例和隨訪資料，由病理專家證實(shí)為宮頸癌，共獲得宮頸癌手術(shù)切除標(biāo)本60例，另選取40例由于良性病變等原因獲得的正常宮頸組織為對照。患者簽署知情同意書，并由醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 試劑與儀器 宮頸癌細(xì)胞系HeLa、caski、siha和人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM高糖、RPIM-1640、DMEM-F12培養(yǎng)基及FBS均購自美國Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒等購自日本TaKaRa公司；LINC01133 siRNA由上海吉凱有限公司設(shè)計合成；蛋白裂解液購自美國Thermo公司；MTS增殖試劑盒購自美國biovision公司；Transwell小室購自美國corning公司； pPI3K抗體(ab125633)、pAKT抗體(ab38449)、GAPDH抗體(ab181602)購自美國Abcam公司。

1.3 qRT-PCR 收集經(jīng)液氮凍存研磨的組織及細(xì)胞，采用TRIzol裂解法提取總RNA。設(shè)計合成LINC01133引物F:5’-GCTGTGGTGGAGAGAATGGA-3’,R:5’-CCCCAGCTTTCCAGATCCA AA-3’。內(nèi)參GAPDH引物F:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’,R:5’-GCCCA ATACGACCAAATCC-3’。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA作為模板并進(jìn)行qRT-PCR獲得各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)，采用2-ΔΔCt法分析各組實(shí)驗數(shù)據(jù)，檢測LINC01133的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞用DMEM高糖+10%FBS培養(yǎng)，Caski、H8細(xì)胞用DMEM-F12+10%FBS培養(yǎng)，siha細(xì)胞用RPIM-1640+10%FBS培養(yǎng)，放置在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中。將呈對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞胰酶消化后鋪至6孔板中，細(xì)胞貼壁18～24 h用脂質(zhì)體2000按說明書將LINC01133 siRNA和對照組NC轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，分為LINC01133 siRNA組(si-LINC01133)和對照組(si-NC)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.5 MTS增殖實(shí)驗 收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-LINC01133和si-NC細(xì)胞，每組以每孔150 μl培養(yǎng)基、2 000個細(xì)胞接種于96孔板中，每組鋪0、1、2、3、4和5 d 的細(xì)胞量，每天6個復(fù)孔，在鋪板后相應(yīng)的時間以每孔加入30 μl MTS工作液培養(yǎng)箱孵育2 h，全波長掃描儀在490 nm波長處測取每孔OD值，OD值越高代表細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。

1.6 Transwell小室實(shí)驗 收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-LINC01133和si-NC細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次后以每孔100 μl無血清培養(yǎng)基、1×105個細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，500 μl含10%FBS培養(yǎng)基加入下室作為趨化因子，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至顯微鏡下觀察穿過掉入下室10個細(xì)胞時，取出上室膜PBS洗3次后甲醇固定15 min，蘇木素染色。顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)5個視野穿過的細(xì)胞，取均值代表細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，穿過細(xì)胞的個數(shù)越多，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。

1.7 劃痕實(shí)驗 收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-LINC01133和si-NC細(xì)胞，每孔2 ml培養(yǎng)基、2×105個細(xì)胞接種于6孔板中置于培養(yǎng)箱，待細(xì)胞完全貼壁后，10 μl槍頭沿直尺方向劃2條劃痕，PBS沖洗3次后，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。顯微鏡下拍照，每24小時記錄1次細(xì)胞遷移的情況。

1.8 Western-blot檢測蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的si-LINC01133和si-NC細(xì)胞，加入蛋白裂解液超聲裂解30 min后，4℃ 14 000 r/min離心20 min，上清液移至新的EP管中，BCA檢測蛋白濃度，變性后行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)，8%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗滌3次后加入目的基因一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育2 h，ELC化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測LINC01133在宮頸癌組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測LINC01133在60例宮頸癌組織和40例正常宮頸組織中的表達(dá)情況。LINC01133在宮頸癌組織中的表達(dá)(1.21±0.43)顯著高于正常宮頸組織(0.84±0.34),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.411,P=0.0000)，LINC01133在腫瘤直徑≥4 cm組織中的表達(dá)顯著高于<4 cm組織中的表達(dá)，LINC01133在TNM分期Ⅲ～Ⅳ組織中的表達(dá)顯著高于Ⅰ～Ⅱ組織中的表達(dá)，LINC01133在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織(P<0.05)。見表1。

項目LINC01133表達(dá)量t值P值年齡(歲) <50(n=31)1.04±0.100.0210.902 ≥50(n=29)1.12±0.13腫瘤大小(cm) <4(n=36)1.14±0.363.4660.001 ≥4(n=24)1.50±0.45組織學(xué)分級 高分化(n=27)1.18±0.230.8120.354 低分化(n=33)1.23±0.43TNM分期 Ⅰ～Ⅱ(n=43)1.16±0.323.8530.000 Ⅲ～Ⅳ(n=17)1.59±0.53淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(n=39)1.16±0.323.4160.001 有(n=31)1.53±0.52

2.2 宮頸癌組織中LINC01133的表達(dá)對患者預(yù)后的影響 對宮頸癌患者術(shù)后隨訪，并按LINC01133在宮頸癌癌組織中的表達(dá)水平分為LINC01133高表達(dá)組和LINC01133低表達(dá)組。Kaplan-Meier繪制患者生存曲線，LINC01133高表達(dá)組宮頸癌患者的5年總生存率明顯短于LINC01133低表達(dá)組(χ2=12.95，P=0.000)。見圖1。

圖1 宮頸癌組織中LINC01133表達(dá)水平與患者術(shù)后生存時間的關(guān)系

2.3 qRT-PCR檢測LINC01133在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示LINC01133在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、caski和siha中的表達(dá)顯著高于人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8，在HeLa中的表達(dá)最高(P<0.05)。選擇LINC01133表達(dá)最高的HeLa細(xì)胞系進(jìn)行LINC01133 siRNA的轉(zhuǎn)染，qRT-PCR檢測顯示si-LINC01133組中LINC01133的表達(dá)為(0.20±0.08)顯著低于si-NC組的(1.01±0.06)。見表2。

細(xì)胞系LINC01133表達(dá)量t值P值HeLa10.14±1.5510.190.000caski5.98±2.233.870.018siha6.17±1.058.520.001H81.00±0.05

2.4 MTS檢測沉默LINC01133表達(dá)對HeLa增殖的影響 采用MTS法測定si-LINC01133和NC組細(xì)胞的增殖能力，與NC組相比，si-LINC01133組細(xì)胞增殖能力明顯減慢(P<0.05)。見表3，圖2。

組別01 d2 d3 d4 d5 dNC組 0.31±0.010.49±0.030.77±0.071.00±0.111.44±0.101.59±0.12si-LINC01133組0.31±0.020.37±0.030.49±0.130.55±0.050.66±0.110.82±0.10P值0.1540.0810.0270.0140.0000.006

圖2 MTS檢測LINC01133對HeLa細(xì)胞增殖能力的影響，與si-NC組比較,*P<0.05

2.5 Transwell小室檢測沉默LINC01133表達(dá)對HeLa轉(zhuǎn)移能力的影響 采用Transwell小室測定si-LINC01133和NC組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，si-LINC01133和NC組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(89.37±9.68)個、(48.14±11.97)個。si-LINC01133組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯低于si-NC組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Transwell檢測LINC01133對HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響(蘇木素染色×100)

2.6 劃痕實(shí)驗檢測沉默LINC01133表達(dá)對HeLa劃痕愈合能力的影響 采用劃痕實(shí)驗測定si-LINC01133和NC組細(xì)胞的遷移能力，si-LINC01133和NC組劃痕愈合比分別為(10.34±0.49)%、(30.98±0.57)%。si-LINC01133組細(xì)胞遷移能力明顯低于si-NC組(P<0.05)。見圖4。

圖4 劃痕實(shí)驗檢測LINC01133對HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

2.7 沉默LINC01133表達(dá)對PI3K/AKT信號通路的影響 采用Western-blot檢測各組Hela細(xì)胞中pPI3K和pAKT蛋白表達(dá)的影響，與si-NC組比較，si-LINC01133組OCT4、pPI3K和pAKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western-blot檢測LINC01133對PI3K/AKT信號通路的影響

3 討論

宮頸癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，已經(jīng)成為重要的公共衛(wèi)生問題[1,2]。宮頸癌的發(fā)病是多因素及多階段的，是由炎癥到癌前病變惡性演變而來，由于HPV感染、性生活過早、早期篩查率等各種原因，宮頸癌的發(fā)病率不斷升高，而這種現(xiàn)象主要發(fā)生在發(fā)展中國家[12-14]。目前宮頸癌的治療主要包括手術(shù)、放化療，但是早期宮頸癌癥狀不明顯，患者常常延誤治療，另一方面，宮頸癌惡性程度高容易發(fā)生局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此宮頸癌患者確診時已由早期進(jìn)展為晚期宮頸癌，導(dǎo)致患者對上述治療手段的療效較差，預(yù)后不良[4,5]。有研究報道早期宮頸癌即Ⅰ～Ⅱ期患者5年總生存率為80%左右，而ⅢA期，ⅢB期和ⅣA期患者的5年總生存率分別僅為40%、42%和22%[15]，由此可見宮頸癌新的治療手段十分重要。分子靶向藥物在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中取得較好的治療效果[16,17]，而宮頸癌的確切分子機(jī)制的不明確，限制了分子靶向藥物療法的研發(fā)。因此本文研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用的分子，以期發(fā)現(xiàn)宮頸癌潛在的分子靶標(biāo)，為分子靶向藥物治療宮頸癌提供實(shí)驗室數(shù)據(jù)。

隨著人類基因組測序高新技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)人類基因組總DNA序列中不到2%的基因編碼蛋白質(zhì)，其余98%的序列沒有編碼蛋白質(zhì)的功能統(tǒng)稱為非編碼RNA[18]，而根據(jù)序列的長度分為長鏈和短鏈非編碼RNA，其中miRNA是短鏈的小RNA，miRNA已被證實(shí)在腫瘤中的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[19,20]，而通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的lncRNA，是與miRNA具有相似結(jié)構(gòu)的長鏈RNA，雖然不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但是與miRNA一樣通過染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響基因的表達(dá)[21]，其表達(dá)異常可引起多種疾病的發(fā)生，F(xiàn)erguson等[22]報道lncRNA在誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥和心臟代謝疾病等方面具有差異表達(dá)。lncRNAs通過調(diào)控抗原加工/呈遞，免疫細(xì)胞增殖和分化以及慢性炎性反應(yīng)在克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[23]。近年來，lncRNAs在腫瘤中的研究也越來越多，結(jié)腸癌患者血漿中LNCV6-116109、LNCV6-98390、LNCV6-38772、LNCV-108266、LNCV6-84003顯著上調(diào)，可作為早期生物標(biāo)志物[24]。lncRNA UCA在肺癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，UCA1的沉默可通過誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯和凋亡來抑制肺癌細(xì)胞的增殖，此外UCA1沉默還可以抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[25]。lncRNA LINC01133，長度為1 154 nt，位于染色體1q23.2上，是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，由Zhang等[8]在2015年首次報道LINC01133在肺鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)；并且LINC01133與黑素瘤的發(fā)生率和發(fā)展顯著相關(guān)[26]。而有報道LINC01133在胃癌和結(jié)腸癌中低表達(dá)，并且低表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)，在細(xì)胞實(shí)驗中LINC01133抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[27,28]。表明LINC01133在不同的腫瘤中的表達(dá)及發(fā)揮功能不一致，而其在宮頸癌中的表達(dá)及作用引起我們的關(guān)注。

首先我們檢測LINC01133在60例宮頸癌和40例正常宮頸組織中的表達(dá)水平，qRT-PCR結(jié)果顯示LINC01133在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，而Huang等[29]采用qRT-PCR檢測LINC01133在胰腺導(dǎo)管腺癌和癌旁組織中的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較LINC01133在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。此外，我們分析發(fā)現(xiàn)LINC01133的在宮頸癌組織中的高表達(dá)與宮頸癌腫瘤大小、腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，同時Kaplan-Meier檢驗發(fā)現(xiàn)LINC01133高表達(dá)的宮頸癌患者5年總生存期較短。而Mao等[11]采用lncRNA表達(dá)譜分析鑒定宮頸鱗癌的預(yù)后相關(guān)的lncRNAs TCGA數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示LINC01133高表達(dá)可以預(yù)測宮頸鱗癌患者存活率低，與本文的研究結(jié)果具有相似性，均能提示LINC01133可能為促癌因子，另外LINC01133在宮頸癌組織中表達(dá)升高可能與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在肺鱗癌細(xì)胞系中劃痕實(shí)驗和transwell實(shí)驗表明，siRNA對LINC01133的沉默可以抑制細(xì)胞的侵襲能力[8]。LINC01133在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，LINC01133的沉默也可以明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞(HOS和U2-OS)的增殖、遷移和侵襲能力[30]。為研究LINC01133是否與宮頸癌的增殖、轉(zhuǎn)移和遷移有關(guān)，在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、caski和siha及人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8中檢測了LINC01133的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LINC01133在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均增高，與組織中的表達(dá)水平具有一致性，其中在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，我們同樣采用siRNA沉默HeLa細(xì)胞中LINC01133的表達(dá)后，MTS增殖實(shí)驗、Transwell實(shí)驗及劃痕實(shí)驗結(jié)果表明抑制LINC01133的表達(dá)后，細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及遷移能力均降低。

干擾宮頸癌細(xì)胞中LINC01133的表達(dá)后，細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為受到顯著的抑制，而其作用的機(jī)制需進(jìn)一步研究。Zheng等[10]報道LINC01133在肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其敲低可以抑制HCC細(xì)胞增殖、細(xì)胞集落形成、G1期阻斷細(xì)胞周期停滯以及HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，LINC01133的沉默在細(xì)胞系水平和裸鼠皮下移植瘤中均可以抑制PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑抑制HCC腫瘤進(jìn)展。PI3K/AKT是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典信號通路[31]，而PI3K/AKT信號傳導(dǎo)在宮頸癌細(xì)胞中高度活化，參與宮頸癌的癌變、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥[32]。MALAT1通過激活PI3K/AKT途徑促進(jìn)宮頸癌中的順鉑耐藥性[33]。lncRNA CRNDE的敲低導(dǎo)致PI3K/AKT途徑失活而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖[34]。因此我們檢測了PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化，Western-blot檢測si-LINC01133組pPI3K和pAKT蛋白表達(dá)水平顯著下降，表明沉默LINC01133的表達(dá)可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制宮頸癌增殖轉(zhuǎn)移，其作用具的體機(jī)制需在后續(xù)研究中進(jìn)行深入探討。

綜上所述，LINC01133在宮頸癌組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，其高表達(dá)與宮頸癌患者的腫瘤直徑大、TNM分期晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后顯著相關(guān)，沉默LINC01133可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制宮頸癌的惡性行為，LINC01133可能為治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)。