高楊 叢力寧 程毅 劉巖
黑色素瘤是一種好發(fā)于皮膚的高度惡性的腫瘤,有易發(fā)生轉(zhuǎn)移,病死率高,預(yù)后差[1,2]等特點,且缺乏較有效的治療手段。斑蝥素是從斑蝥的干燥蟲體中提取的一種抗腫瘤活性成分,具有抗腫瘤、升白細胞、增強免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用,臨床上可用于治療多種腫瘤。去甲斑蝥素是斑蝥素的衍生物,由人工合成,其毒副作用比斑蝥素低,具有獨特的升白細胞作用及較強的抗癌作用。本研究通過去甲斑蝥素作用于人黑色素瘤M14細胞,觀察去甲斑蝥素對M14細胞凋亡和有關(guān)凋亡基因及細胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響,探討其可能的抗腫瘤作用機制。
1.1 材料與試劑 人M14黑素瘤細胞株,購于中國科學院上海細胞研究所;去甲斑蝥素購于美國Sigma 公司,1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,CCK8試劑購于日本同仁化學研究所,Trizol試劑購于Invitrogen公司、高效RIPA裂解液購于北京索萊寶來生物技術(shù)有限公司,PCR引物購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司,活性氧檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng):M14細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài),待細胞融合達到90%以上時,按1∶2或1∶3的比例進行傳代。將細胞分為空白對照組和50、100、500 μg/L去甲斑蝥素給藥組。
1.2.2 CCK8檢測:細胞活性將對數(shù)生長期的M14細胞接種于96 孔板中,每孔5×103個細胞,每組設(shè)5個平行孔,待細胞貼壁后,棄去原培養(yǎng)液,實驗組每孔加入100 μl的藥物,濃度分別為0、50、100、500 μg/L,只加培養(yǎng)基無細胞孔為空白對照組。分別作用12、24 h后,加CCK8每孔10 μl作用2 h,用酶標儀測定每孔450 nm波長的吸光度值并計算抑制率。生長抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%。
1.2.3 qRT-PCR法檢測凋亡相關(guān)mRNA的表達
1.2.3.1 Trizol法提取細胞總RNA:貼壁細胞PBS洗滌3次,加入1 ml Trizol,吹打充分混勻,移至EP管,冰盒靜置5 min,加入0.2 ml氯仿,上下劇烈震蕩15 s,冰盒靜置5 min,2 min,4℃離心,12 000 r/min×15 min,取上層水相移入一新無RNase管中,加入等體積異丙醇,冰盒靜置10 min,4℃離心,12 000 r/min×10 min。棄上清,管中白色沉淀即RNA,去除殘液后加入0.4 ml 75%乙醇洗滌,4℃離心,9 000 r/min×5 min,棄上清,晾干RNA。加入40 μl ddH2O溶解,吹打混勻,-80℃保存。
1.2.3.2 總RNA質(zhì)量的檢測:測定RNA樣品的OD260及OD280,計算RNA的濃度,以O(shè)D260/OD280,保證其比值在1.9~2.0,若偏差過大,則表示RNA有污染,判斷RNA樣品中有無蛋白質(zhì)或者有機溶劑污染。
1.2.3.3 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。見表1。
表1 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA反應(yīng)體系
1.2.3.4 qRT-PCR GAPDH為內(nèi)參,每個樣品設(shè)3個復(fù)孔,總體積為20 μl。充分混勻,操作IQ5軟件:熱學過程:95℃×5 min,95℃×15 s,58℃×30 s,72℃×30 s,共40個重復(fù)循環(huán),采集PCR產(chǎn)物熒光值。結(jié)束后,設(shè)置溶解曲線程序:95℃×15 s,60℃~95℃,緩慢升溫,產(chǎn)生熔點曲線或稱解離曲線。設(shè)閾值,檢測mRNA的表達情況。見表2。
表2 qRT-PCR GAPDH為內(nèi)參反應(yīng)體系
1.2.3.5 引物序列:見表3。
表3 引物序列
1.2.4 雙重加熱法檢測MDA的水平。其實驗原理基于硫代巴比妥(TBA)和MDA反應(yīng)產(chǎn)生的紫色,通過比色法間接測定MDA的水平。調(diào)整M14細胞濃度為1.0×105個,接種于6孔板,37℃、5% CO2溫箱中孵育過夜。加入不同濃度的去甲斑蝥素后孵育24 h后離心收集細胞。加入200 μl細胞裂解液充分裂解后,1 600 r/min離心10 min取上清,按照試劑盒的操作說明,加入TBA溶液,95℃煮沸40 min。樣品迅速冷卻至室溫,并按要求加入96孔板中,在532 nm酶標儀測定吸光光度值。MDA含量為每毫克蛋白質(zhì)中的納摩爾數(shù)。
1.2.5 細胞內(nèi)ROS水平檢測:DCFH-DA被自由基(H2O2)去乙酰化轉(zhuǎn)變?yōu)槠錈晒猱a(chǎn)物DCF,通過檢測DCF的熒光值,可間接檢測細胞內(nèi)ROS的水平。調(diào)整M14細胞濃度為1.0×105個,接種于6孔板,37℃、5% CO2溫箱中孵育過夜。加入不同濃度的去甲斑蝥素后孵育24 h后收集細胞。按照活性氧檢測試劑盒的操作說明,用DCFH-DA 熒光探針標記細胞,利用熒光酶標儀在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長下測定不同組別中DCF 的熒光值。
2.1 去甲斑蝥素抑制M14細胞增殖 CCK8結(jié)果所示,去甲斑蝥素可抑制黑素瘤M14細胞的增殖,藥物作用24 h后各組的細胞生長抑制率比較有顯著差異(F=135.76,P<0.05),作用48 h后亦有顯著差異(F=96.12,P<0.05),經(jīng)兩兩比較,各濃度去甲斑蝥素與陰性對照組組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。
組別24 h凋亡率48 h凋亡率對照組 6.34±1.037.86±1.3750 μg/L NCTD 14.57±1.45?18.89±2.13?100 μg/L NCTD38.48±2.67?#46.18±3.06?#500 μg/L NCTD56.72±3.78?#△63.57±3.64?#△
注:與對照組比較,*P<0.05;與50 μg/L NCTD比較,#P<0.05;與100 μg/L NCTD比較,△P<0.05
2.2 去甲斑蝥素對凋亡相關(guān)基因的影響 采用RT-PCR法檢測去甲斑蝥素對人M14黑色素瘤細胞中凋亡基因mRNA的影響。去甲斑蝥素作用M14細胞24、48 h后,均能夠升高凋亡相關(guān)基因Bax、caspase-3、caspase-9、細胞色素c的mRNA的表達,減少凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達(P<0.05)。見表5。
組別Bax相對mRNAcaspase-3相對mRNAcaspase-9相對mRNA細胞色素c相對mRNABcl-2相對mRNA對照組 1111150 μg/L NCTD1.11±0.251.07±0.181.05±0.030.83±0.110.83±0.08100 μg/L NCTD1.32±0.0451.74±0.09#1.34±0.05#1.18±0.06?0.60±0.16#500 μg/L NCTD1.47±0.085?1.74±0.38#1.42±0.04#1.25±0.08#0.40±0.11#
注:與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01
2.3 去甲斑蝥素對M14細胞中ROS的影響經(jīng)過藥物處理人M14黑色素瘤細胞24 h后,采用熒光探針標記法檢測不同濃度去甲斑蝥素作用在人M14黑色素瘤細胞ROS水平。如圖3顯示結(jié)果發(fā)現(xiàn),去甲斑蝥素能明顯的提高細胞內(nèi)ROS水平(F=22.029,P<0.05),與對照組對比,各實驗組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6,圖1。
組別ROS相對含量對照組 150 μg/L NCTD 1.31±0.035?100 μg/L NCTD1.25±0.04?500 μg/L NCTD1.34±0.10?
注:與對照組比較,*P<0.01
圖1 熒光探針法檢測去甲斑蝥素對黑素瘤M14細胞ROS的影響
2.4 去甲斑蝥素對M14細胞中MDA的影響經(jīng)過不同濃度藥物處理人M14黑色素瘤細胞24 h后,采用雙重加熱法檢測不同濃度去甲斑蝥素作用在人M14黑色素瘤細胞后的MDA水平。去甲斑蝥素能明顯的提高細胞內(nèi)MDA水平(F=14.230,P<0.05),且呈劑量依賴性。與對照組相比,100 μg/L、500 μg/L 2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7,圖2。
組別MDA對照組 0.31±0.0450 μg/L NCTD 0.56±0.10100 μg/L NCTD0.88±0.13?500 μg/L NCTD0.99±0.23#
注:與對照組比較,*P<0.05,#P<0.01
圖2 雙重加熱法檢測去甲斑蝥素對黑素瘤M14細胞丙二醛(MDA)的影響
去甲斑蝥素(noncantharidin,NCTD)為斑蝥素的衍生物,是人工合成的一種新型抗癌藥物,是一種水溶性合成小分子,與斑蝥素相似,其摩爾質(zhì)量、復(fù)雜度和重原子數(shù)分別為168.15 g/mol、246和12。NCTD可以引起多種細胞系的凋亡,目前已有研究表明去甲斑蝥素對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞[1]、骨髓瘤U266細胞[2]、肺腺癌A549細胞[3]、胰腺癌PANC1細胞[4]、胃癌SGC7901細胞[5]、乳腺癌MCF7細胞[6]等均具有抑制作用。此外,它還可以抑制血管的生成和轉(zhuǎn)移,影響控制細胞增殖的多種途徑。
目前,包括Wnt/β-連環(huán)蛋白,Sonic hedgehog(Shh)和Notch信號通路在內(nèi)的幾種途徑已被確定在癌癥干細胞的自我更新中起到關(guān)鍵作用,并可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和多藥耐藥,以及血管生成,遷移,侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。去甲斑蝥素可以促進β-catenin活化的喪失并抑制具有顯性β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的Jurkat細胞的增殖[8];NCTD可抑制了乳腺癌各種細胞系的Shh表達[9];NCTD劑量依賴性地抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞中Akt和NF-κB表達的磷酸化[10]。此外,NCTD在低濃度(0.2~0.8 μg/ml)下使人肺癌A549細胞遷移減少超過65%而不影響細胞活力[11]。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK),c-Jun NH2-末端激酶(JNK)的激活和下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)節(jié)參與NCTD誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細胞凋亡[12];這表明NCTD具有用活化的Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑治療癌癥的顯著潛力。在對單一藥物或一類藥物產(chǎn)生耐藥性后,癌細胞對其他功能和結(jié)構(gòu)不相關(guān)的藥物表現(xiàn)出交叉耐藥性,導(dǎo)致癌細胞治療失敗,這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)。盡管目前已研究了MDR的許多機制,但最重要的機制可能是通過細胞膜上藥物轉(zhuǎn)運蛋白將藥物主動移出從而減少細胞內(nèi)藥物積累。這些藥物轉(zhuǎn)運蛋白為ATP結(jié)合蛋白,包括p-糖蛋白,多藥耐藥蛋白1、多藥耐藥蛋白2,肺耐藥蛋白、和乳腺癌耐藥蛋白等[7]。NCTD可抑制異質(zhì)性人上皮結(jié)腸直腸腺癌細胞單層模型中p-糖蛋白[13]和多藥耐藥相關(guān)蛋白2的表達[14],誘導(dǎo)對多種化療藥物具有耐藥性的口腔癌細胞的凋亡[15]。在對多柔比星耐藥的人乳腺癌MCF-7R細胞的研究中,NCTD增加了MCF-7R細胞中多柔比星的細胞內(nèi)積累,并抑制了多藥耐藥蛋白1 mRNA,p-糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白表達的上調(diào)[16]??偟膩碚f,NCTD可能是P-糖蛋白的底物,可能會克服癌細胞的多藥耐藥性。本課題組在前期的實驗研究中,經(jīng)流式細胞術(shù)檢測到去甲斑蝥素對人A375細胞有促進凋亡的作用,本實驗通過CCK8法分析去甲斑蝥素體外作用于人黑色素瘤M14細胞,結(jié)果顯示去甲斑蝥素對黑色素瘤細胞具有明顯的生長抑制作用,并且呈時間-劑量依賴性。在前期實驗中,我們還通過DAPI染色法通過熒光顯微鏡下觀察去甲斑蝥素對黑素瘤M14細胞核結(jié)構(gòu),出現(xiàn)細胞核固縮、核邊集及凋亡小體等細胞凋亡形態(tài)學改變,證實去甲斑蝥素對人黑色素瘤M14細胞有抑制作用,但其作用機制尚不明確[17]。在本試驗中,我們研究了去甲斑蝥素是否可以在M14細胞中激活線粒體途徑而誘導(dǎo)細胞凋亡。
細胞凋亡是發(fā)生在多細胞生物中的程序性細胞死亡的過程,這個過程包括起泡,細胞收縮,核碎裂,染色質(zhì)濃縮,染色體DNA片段化和mRNA全面衰變[18]。基于刺激因素的不同,細胞凋亡通常通過激活外源性(死亡受體)途徑或內(nèi)在(線粒體)途徑。內(nèi)源性途徑通常被來自于細胞內(nèi)部的壓力激活,由一連串的刺激因素誘導(dǎo),包括DNA損傷和生長因子減少,這些刺激信號最終觸發(fā)線粒體外膜通透性增加(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)。其中線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)通透性增加一般是由于某些促凋亡BCL-2家族成員激活的結(jié)果[19]。Bcl-2家族包括凋亡抑制因子和凋亡促進因子兩大類,凋亡抑制因子包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等,Bax、Bak、Bcl-xS等為凋亡促進因子。Bax與Bcl-2是一對同源或者異源二聚體,當細胞DNA受損時,Bax表達增強,可與Bcl-2形成同源二聚體,拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用,從而激活線粒體凋亡通路,引起細胞凋亡。有文獻報道,ROS可作為細胞的第二信使調(diào)控細胞增長、促進細胞增殖,但是過高的ROS水平會使細胞因氧化過度而受損,導(dǎo)致細胞凋亡[20]。ROS介導(dǎo)的細胞損傷在早期會引起細胞膜脂質(zhì)過氧化,同時伴有MDA的產(chǎn)生,因此MDA可間接評價細胞遭受氧化應(yīng)激損傷的嚴重程度[21]。在前期的研究中,我們通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)10~40 μmo/L去甲斑蝥素作用在人A375黑色素瘤細胞48 h后,ROS水平明顯有所提高,且呈劑量依賴性。本實驗我們進一步通過熒光探針法檢測去甲斑蝥素對M14黑素瘤細胞ROS的影響,結(jié)果顯示去甲斑蝥素同樣可增加M14細胞內(nèi)的ROS水平。同時,細胞內(nèi)的MDA水平也升高,間接反映了細胞受到了過度的氧化應(yīng)激損傷。同時,通過RT-PCR我們還發(fā)現(xiàn),隨著去甲斑蝥素濃度的升高,凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Capase-9、Bax、細胞色素c基因的mRNA表達量逐漸升高,而凋亡抑制基因Bcl-2的mRNA表達量逐漸降低。綜合以上結(jié)果,我們推測去甲斑蝥素可誘導(dǎo)M14細胞凋亡,其作用可能與去甲斑蝥素引發(fā)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激進而啟動線粒體途徑的凋亡通路有關(guān),去甲斑蝥素有望成為治療黑素瘤的有效輔助性藥物。