Adk1過(guò)表達(dá)和檸檬酸鈉補(bǔ)料促進(jìn)酵母S-腺苷甲硫氨酸的合成

陳海龍, 蔣麗華, 陳帥, 張曉戈, 朱年青, 韋平和*, 周長(zhǎng)林

(1.泰州學(xué)院, 江蘇手性醫(yī)藥化學(xué)品省高校重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 泰州 225300;2.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 南京 210009)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是重要生理活性物質(zhì)。它作為甲基供體、丙氨基供體及巰基化合物前體等參與體內(nèi)眾多生化反應(yīng)，如核酸、蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)和維生素等的合成，半胱氨酸、谷胱甘肽、多胺以及輔酶A和?；撬岬群蚧衔锏南嗷マD(zhuǎn)化[1-3]，常被用于肝炎、原發(fā)膽汁性肝硬化、酒精造成的肝損傷等疾病的防治，同時(shí)SAM還是抗衰老高級(jí)保健藥品[4-7]。在植物體內(nèi)，SAM還參與乙烯、甜菜堿以及木質(zhì)素的合成和代謝過(guò)程[8-9]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝及逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中都發(fā)揮重要作用，如SAM處理黃瓜扦插苗可促進(jìn)根系生長(zhǎng)發(fā)育、葉綠素積累、光合速率增強(qiáng)，增加下胚軸內(nèi)生長(zhǎng)素和多胺的積累及其相關(guān)基因的表達(dá)[10]。

微生物發(fā)酵法因其底物轉(zhuǎn)化率高及產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)而成為獲取SAM的重要途徑，一直倍受關(guān)注[3-4]。微生物合成SAM的研究集中在以下幾個(gè)方面[1, 2, 5]：①通過(guò)菌種誘變選育和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化；②利用基因工程技術(shù)改善SAM合成酶的活性；③敲除胱硫醚-β合成酶基因提高胞內(nèi)前體甲硫氨酸(Met)水平；④通過(guò)異源酶引入或關(guān)鍵酶重組等方法來(lái)解除胞內(nèi)大量積累的SAM對(duì)SAM合成酶(SAMS)和甲叉四氫葉酸還原酶的反饋抑制作用；⑤通過(guò)ATP代謝調(diào)控提高胞內(nèi)ATP水平等。酵母屬微生物很多基因與SAM合成和積累有關(guān)，如SAM1、SAM2、MET13、MET6、CYS4等[2-6]。但微生物生物合成和積累SAM的能力尚未得到充分發(fā)掘，SAM積累量并未得到突破，其工業(yè)化生產(chǎn)尚存在一些問(wèn)題：如發(fā)酵過(guò)程中，隨著外源甲硫氨酸流加到發(fā)酵液中，SAM生產(chǎn)成本增加，且發(fā)酵液中大量Met存在會(huì)抑制Met透性酶基因MUP1及SAM合成酶基因SAM2的表達(dá)；胞內(nèi)調(diào)控SAM合成與積累的機(jī)制并未闡明，胞內(nèi)ATP水平限制SAM的合成，SAM在胞內(nèi)大量積累后引起反饋抑制作用等[11-12]。

在生物體內(nèi)，SAM在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)催化下將ATP腺苷基團(tuán)轉(zhuǎn)移給Met而合成，會(huì)消耗酵母細(xì)胞內(nèi)ATP[1]。因此，酵母胞內(nèi)ATP的水平是限制胞內(nèi)SAM合成的因素之一[13]。在前體氨基酸充分情況下，向酵母發(fā)酵液中添加適量ATP可以改善SAM的合成與積累，但ATP價(jià)格昂貴，通過(guò)ATP補(bǔ)料策略改善SAM發(fā)酵工藝難以實(shí)現(xiàn)。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加具有ATP導(dǎo)向作用的氨基酸能夠改善胞內(nèi)ATP水平，從而增加SAM的積累量。顧振霆等[15]對(duì)E.coli的腺嘌呤補(bǔ)救途徑進(jìn)行系統(tǒng)研究，敲除E.coli腺苷脫氨酶基因add、AMP核苷酶基因amn和嘌呤核苷磷酸酶基因deoD并引入酵母腺苷酸激酶基因Adk1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，工程菌胞內(nèi)AMP、ADP和ATP的水平均得到顯著改善。關(guān)于利用微生物細(xì)胞內(nèi)ATP代謝調(diào)控來(lái)直接生產(chǎn)ATP或?qū)TP利用到一些藥用化學(xué)物分子的生物合成研究也已成為熱點(diǎn)問(wèn)題。這些研究大多集中在基于腺嘌呤補(bǔ)救途徑相關(guān)基因的調(diào)控來(lái)提高ATP的供給最終實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物積累量的提高。

釀酒酵母腺苷酸激酶ADK1，由Adk1基因編碼，主要負(fù)責(zé)催化AMP生成ATP。本研究以課題組前期通過(guò)紫外誘變育種技術(shù)并結(jié)合乙硫基抗性篩選得到一株高產(chǎn)SAM的突變菌株SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2842為出發(fā)菌株，通過(guò)Adk1基因的過(guò)表達(dá)和檸檬酸鈉補(bǔ)料調(diào)控酵母胞內(nèi)ATP水平，考察其對(duì)工程菌胞內(nèi)SAM積累的影響和機(jī)理，為基于ATP代謝調(diào)控而改善SAM合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

釀酒酵母CGMCC 2842(2842)及其表達(dá)載體pYES-KanMx為中國(guó)藥科大學(xué)周長(zhǎng)林課題組篩選和構(gòu)建，酵母重組工程菌YPA和空質(zhì)粒對(duì)照菌株YPK均為本課題組構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g·L-1，酵母浸粉 10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，自然pH，115 ℃滅菌30 min；YPD固體培養(yǎng)基在YPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加2%瓊脂。

O-medium培養(yǎng)基：葡萄糖 50 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，酵母浸粉 5 g·L-1，KH2PO44g·L-1，K2HPO42 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1，L-methionine 3 g·L-1，用磷酸調(diào)至pH 6.0，115 ℃滅菌30 min。

1.3 主要試劑和儀器

SanPrep柱式DNA質(zhì)粒提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒、酵母總RNA提取試劑盒、a StepOnePlus Instrument試劑盒、ExTaq聚合酶、T4 DNA連接酶、ATP、Met和SAM標(biāo)準(zhǔn)品等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；BamHⅠ、EcoRⅠ和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

C1000 PCR儀、Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；DYY-6C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源、DYCP-31 DN型電泳槽，北京六一儀器廠；Scientz JY92-II超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；LC10A高效液相色譜儀，日本島津；Hypersil ODS C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，大連依利特分析儀器有限公司。

1.4 Adk1基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的Adk1(GenBank：NC_001136.10)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，Adk1-F：5’-CGCGGATCCATGTCTAGCTCAGAATCC-3’；Adk1-R：5’-CCGGAATTCGCTAGGTAAGGATTAATGA-CC-3’。

以釀酒酵母基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL：10×ExTaqPCR Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)3 μL，基因組DNA 1 μL，PrimerAdk1-F/R各1 μL；ExTaqDNA polymerase 0.25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 pGAL1-Adk1質(zhì)粒構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

將Adk1基因和質(zhì)粒pYES-KanMax分別用BamH I和EcoR I酶切后，T4 DNA連接酶連接后采用CaCl2法[6, 16]轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，用SanPrep柱式DNA質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，電泳檢測(cè)采用0.8%瓊脂糖凝膠。重組質(zhì)粒用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切并測(cè)序驗(yàn)證后，成功獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGAL1-Adk1。

采用醋酸鋰法[6]制備和轉(zhuǎn)化釀酒酵母CGMCC 2842的感受態(tài)，用200 μg·mL-1的G418篩選陽(yáng)性克隆，獲得Adk1過(guò)表達(dá)菌株YPA。同時(shí)，用空質(zhì)粒pYES-kanMx轉(zhuǎn)化2842菌株，得到空質(zhì)粒對(duì)照菌株YPK。

1.6 重組工程菌YPA檸檬酸鈉補(bǔ)料試驗(yàn)

1.6.1補(bǔ)料時(shí)間確定 挑取酵母重組菌株YPA菌種，于含有200 μg·mL-1G418的YPD斜面劃線接菌，于30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)20 h。挑取活化菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中, 30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)20 h。以5%接種量轉(zhuǎn)接到含50 mL O-medium培養(yǎng)基的250 mL搖瓶，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)。分別在發(fā)酵0、8、16 和24 h后，向發(fā)酵液中添加2 g·L-1檸檬酸鈉，振蕩培養(yǎng)。每4 h取樣并測(cè)定生物量和SAM積累量。

1.6.2補(bǔ)料濃度確定 獲得最佳補(bǔ)料時(shí)間后，分別添加0、2、4、6和8 g·L-1檸檬酸鈉，振蕩培養(yǎng)。每4 h取樣測(cè)定生物量和SAM積累量。

1.7 熒光定量PCR

按照總RNA提取試劑盒提取RNA。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒以1 μg總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。IDH基因的轉(zhuǎn)錄水平使用一步法熒光定量PCR測(cè)定，步驟按照a StepOnePlus Instrument試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Real-time qPCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性5 s，60 ℃延伸31 s，40個(gè)循環(huán)。

1.8 異檸檬酸裂解酶IDH酶活測(cè)定

取5 mL發(fā)酵液，8 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集細(xì)胞，5 mL 0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH 7.0)重懸。然后用超聲波細(xì)胞破碎儀于冰浴中超聲波處理破碎細(xì)胞， 4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，上清液即為測(cè)定IDH粗酶液，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞粗提液的總蛋白濃度用Folin-酚試劑法測(cè)定[16-17]。IDH酶活測(cè)定方法參照LIN等[18]方法進(jìn)行。1 mg蛋白1 min內(nèi)催化形成NADH的量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.9 胞內(nèi)ATP水平測(cè)定

樣品制備：取1 mL發(fā)酵液離心取細(xì)胞沉淀，與2.0 mL 1.5 mol·L-1的高氯酸溶液混勻，于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴反應(yīng)30 min充分裂解，再以KOH調(diào)節(jié)pH至7，以8 000 r·min-1離心10 min，取上清過(guò)0.22 μm濾膜即為HPLC測(cè)定胞內(nèi)ATP水平的樣品。

色譜條件：反相C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱溫為室溫，流動(dòng)相流速為1.0 mL· min-1，上樣體積10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流動(dòng)相為50 mmol·L-1，pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液(含1 mmol·L-1EDTA)與甲醇(體積比95/5)混合溶液。

1.10 SAM積累量測(cè)定

樣品制備：每隔4 h取1.0 mL發(fā)酵液，與2.0 mL 1.5 mol·L-1的高氯酸溶液混勻，于40 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，再與2.0 mL 1.25 mol·L-1的氨水中和，8 000 r·min-1離心10 min，取上清過(guò)0.22 μm濾膜，即為測(cè)定SAM含量的樣品。

色譜條件：反相C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱溫為40 ℃，上樣體積為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;流動(dòng)相為0.1 mol·L-1的甲酸銨溶液(pH 3.0),流速為1.0 mL·min-1。

1.11 Met積累量測(cè)定

HPLC法檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，樣品制備和其余他色譜條件同SAM的測(cè)定。

1.12 DCW測(cè)定

每隔4 h取3 mL發(fā)酵液于預(yù)先編號(hào)并稱重(W0)的5 mL EP管中，8 000 r· min-1離心10 min，棄去上清，雙蒸水清洗兩次，110 ℃烘干至恒重，冷卻稱重(W1)，計(jì)算細(xì)胞干重。

DCW= (W1-W0) ×1 000/3

1.13 葡萄糖消耗分析

用3, 5-二硝基水楊酸法(DNS法)[19]測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌YPA的構(gòu)建與篩選

將PCR產(chǎn)物Adk1與pYES-KanMx經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后通過(guò)T4連接酶酶連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，成功獲得pGAL1-Adk1重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pGAL1-Adk1轉(zhuǎn)化釀酒酵母2842，陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到含有50 mL O-medium的搖瓶中，發(fā)酵16 h時(shí)添加2% D-半乳糖誘導(dǎo)基因表達(dá)，測(cè)定48 h SAM積累量。從圖1中可看出，YPA 1～5號(hào)工程菌SAM產(chǎn)量分別達(dá)到0.72、0.77、0.79、0.79和0.81 g·L-1，較出發(fā)菌2842均顯著提高。結(jié)果表明，成功構(gòu)建釀酒酵母工程菌YPA。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level between different treatments. 圖1 工程菌YPA的SAM積累量Fig.1 Construction and screening of the recombinant strain YPA

2.2 工程菌YPA發(fā)酵性能分析

由圖2可知，48 h時(shí)工程菌YPA的發(fā)酵液中SAM積累量達(dá)到了0.81 g·L-1，較出發(fā)菌株提高47%，同時(shí)考察YPA菌株發(fā)酵液中生物量變化及葡萄糖消耗的情況。發(fā)酵48 h時(shí)，DCW達(dá)到7.59 g·L-1，其葡萄糖消耗能力較2842和空質(zhì)粒重組菌沒(méi)有明顯變化，表明Adk1過(guò)表達(dá)對(duì)工程菌生長(zhǎng)狀況沒(méi)有顯著影響。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level between different treatments.圖2 Adk1的過(guò)表達(dá)有效促進(jìn)酵母SAM的積累Fig.2 Overexpression of Adk1 efficiently enhanced SAM accumulation in S. cerevisiae

另外，分析比較工程菌YPA的SAM和生物量得率變化情況，結(jié)果表明，與出發(fā)菌株2842相比，YPA菌株SAM對(duì)生物量的得率和SAM對(duì)葡萄糖消耗的得率顯著提高，生物量對(duì)葡萄糖的得率較2842稍有下降(表1)。

表1 Adk1的過(guò)表達(dá)有效促進(jìn)酵母細(xì)胞SAM的合成和得率Table 1 Overexpression of Adk1 improved SAM production and yield in Saccharomyces cerevisiae

2.3 Adk1基因過(guò)表達(dá)對(duì)工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平的影響

由于Adk1基因過(guò)表達(dá)能夠有效提高工程菌SAM合成，對(duì)工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)酵36 h時(shí)，重組釀酒酵母YPA、YPK和2842胞內(nèi)ATP水平分別達(dá)到0.75、0.50和0.51 g·L-1，與出發(fā)菌2842相比，工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平提高47.1%(圖3)。結(jié)果表明，Adk1過(guò)表達(dá)能夠有效改善釀酒酵母胞內(nèi)ATP水平，進(jìn)而促進(jìn)Met轉(zhuǎn)化為SAM。

2.4 檸檬酸補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵液中SAM的積累和得率的影響

在發(fā)酵開(kāi)始0、8、16 和24 h時(shí)，向發(fā)酵液中添加 2 g·L-1檸檬酸鈉。對(duì)照組(Control)未添加補(bǔ)料，發(fā)酵48 h后測(cè)定其SAM積累量。在發(fā)酵開(kāi)始0、8、16和24 h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中一次性補(bǔ)加2 g·L-1檸檬酸鈉，發(fā)酵液中SAM的積累量分別達(dá)到0.81、0.85、1.19、1.32和1.01 g·L-1。結(jié)果(圖4)表明，發(fā)酵開(kāi)始16 h檸檬酸鈉補(bǔ)料組的SAM積累量最高。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level between different treatments.圖3 工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平測(cè)定Fig.3 ATP level of recombinant strain YPA

由圖4可知，在發(fā)酵16 h時(shí)向發(fā)酵培養(yǎng)基中一次性補(bǔ)加0、2、4、6和8 g·L-1檸檬酸鈉，分別使發(fā)酵液中SAM積累量達(dá)到0.81、0.92、1.05、1.45和1.32 g·L-1。其中，發(fā)酵開(kāi)始16 h時(shí)補(bǔ)加6 g·L-1檸檬酸鈉使SAM積累量及其對(duì)生物量和葡萄糖得率較對(duì)照組分別提高79%、78.8%和35.2%(表2)。結(jié)果表明，發(fā)酵開(kāi)始16 h時(shí)補(bǔ)加6 g·L-1檸檬酸鈉能夠有效促進(jìn)工程菌YPA的SAM積累及其得率。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level between different treatments. 圖4 檸檬酸鈉補(bǔ)料促進(jìn)工程菌SAM的合成Fig.4 Sodium citrate feeding enhanced SAM accumulation in the recombinant strain

表2 檸檬酸鈉補(bǔ)料改善重組菌SAM得率Table 2 Sodium citrate feeding improved SAM yield in the recombinant strain YPA

2.5 檸檬酸鈉補(bǔ)料對(duì)IDH基因轉(zhuǎn)錄和IDH酶活性的影響

考察對(duì)照組和補(bǔ)料組酵母TCA循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶mRNA水平和酶活性。從圖5可以看出，檸檬酸鈉補(bǔ)料組mRNA相對(duì)水平顯著高于對(duì)照組，與之相對(duì)應(yīng)的是補(bǔ)料組IDH酶活也顯著高于未補(bǔ)料組。結(jié)果表明，檸檬酸鈉補(bǔ)料能夠有效促進(jìn)工程菌YPA胞內(nèi)IDH基因的轉(zhuǎn)錄及IDH的酶活性。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level between different treatments. 圖5 檸檬酸鈉補(bǔ)料改善工程菌IDH基因表達(dá)和IDH酶活性Fig.5 Sodium citrate improve IDH gene expression and IDH activity

2.6 檸檬酸鈉補(bǔ)料對(duì)胞內(nèi)ATP水平和胞內(nèi)Met轉(zhuǎn)化SAM的影響

為驗(yàn)證IDH酶活性改善是否提高工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平及高ATP水平是否能夠促進(jìn)Met轉(zhuǎn)化為SAM，分析未補(bǔ)料組和補(bǔ)料組胞內(nèi)ATP和Met水平(圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),補(bǔ)料組重組工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平顯著高于未補(bǔ)料組，在發(fā)酵24 h時(shí)，檸檬酸鈉補(bǔ)料組胞內(nèi)ATP的水平較未補(bǔ)料組提高39.4%。與之對(duì)應(yīng)，檸檬酸鈉補(bǔ)料組胞內(nèi)Met水平顯著低于未補(bǔ)料組。結(jié)果表明,檸檬酸鈉補(bǔ)料有效改善工程菌YPA胞內(nèi)ATP水平，進(jìn)而有效促進(jìn)胞內(nèi)Met轉(zhuǎn)化成SAM。

注:相同時(shí)間不同小寫(xiě)字母表示處理間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Note: Different lowercase letters at the same time indicate significant difference at P<0.05 level between different treatments.圖6 檸檬酸鈉補(bǔ)料提高工程菌胞內(nèi)ATP水平進(jìn)而促進(jìn)SAM合成Fig.6 Sodium citrate addition elevate intracellular ATP levels and promote SAM synthesis

3 討論

在生物體內(nèi)，SAM是S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)催化下將ATP腺苷基團(tuán)轉(zhuǎn)移到Met而合成,該反應(yīng)必需有K+、Mg2+等金屬離子參與[1]。關(guān)于利用微生物細(xì)胞內(nèi)ATP代謝調(diào)控來(lái)直接生產(chǎn)ATP或者將ATP利用到一些藥用化學(xué)物分子的生物合成的研究也已經(jīng)成為熱點(diǎn)問(wèn)題。這些研究大多集中在關(guān)于基于腺嘌呤補(bǔ)救途徑相關(guān)基因的調(diào)控來(lái)提高ATP的供給最終實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物積累量的提高。

本研究基于課題組前期通過(guò)紫外誘變育種技術(shù)并結(jié)合乙硫基(ethionine)的抗性篩選得到的一株高乙硫氨酸抗性且高產(chǎn)SAM的突變菌株SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2842(2842)[6]。由于2842具有較高的乙硫氨酸耐受性，而乙硫氨酸是作為SAM前體物質(zhì)之一Met的結(jié)構(gòu)類似物，因而2842對(duì)Met及SAM都具有了較高耐受性，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加足夠量的Met的前提下，胞內(nèi)ATP水平就成為限制SAM大量合成的因素之一[9,18-19]。本研究在2842菌株中克隆和過(guò)表達(dá)Adk1，發(fā)現(xiàn)工程菌YPA發(fā)酵液中SAM積累量達(dá)了0.81 g·L-1，較出發(fā)菌株提高47%；同時(shí)考察YPA菌株發(fā)酵液中生物量變化及葡萄糖消耗的情況，其葡萄糖消耗能力較2842和空質(zhì)粒重組菌沒(méi)有明顯變化，即Adk1過(guò)表達(dá)對(duì)工程菌生長(zhǎng)狀況沒(méi)有顯著影響。而與出發(fā)菌株2842相比，YPA菌株的SAM對(duì)生物量的得率和SAM對(duì)葡萄糖消耗的得率有所提高，生物量對(duì)葡萄糖的得率和2842稍有下降。徐柏年等在釀酒酵母中克隆表達(dá)了Adk1基因，結(jié)果工程菌胞內(nèi)ATP的積累量較出發(fā)菌株提高了75%[7]。HARIT等[7]在畢赤酵母中異源表達(dá)來(lái)自釀酒酵母Saccharomycescerevisiae的Sam2基因、一個(gè)甲硫氨酸透性酶Mup1基因和腺苷激酶編碼基因Adk1基因，結(jié)果通Adk1的過(guò)表達(dá)提高了腺苷的供給，通過(guò)過(guò)表達(dá)Met透性酶Mup1提高前體蛋氨酸水平的可利用度，通過(guò)這三個(gè)基因的共表達(dá)最終將胞內(nèi)SAM的積累量較單獨(dú)過(guò)表達(dá)Sam2提高77%。因此，通過(guò)前體物質(zhì)代謝途徑關(guān)鍵酶基因的過(guò)表達(dá)技術(shù)提高前體蛋氨酸可利度以及提高ATP供給，對(duì)于SAM大量積累具有積極的作用。

為進(jìn)一步改善酵母胞內(nèi)SAM的合成與積累，繼而考察檸檬酸鈉補(bǔ)料對(duì)重組工程菌胞內(nèi)ATP和SAM積累的影響。檸檬酸鹽作為一種常見(jiàn)化學(xué)試劑，能夠調(diào)整磷酸己糖(HMP)和糖酵解(EMP)途徑之間的碳原子流的比例，同時(shí)檸檬酸還可抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性從而導(dǎo)致在磷酸尿嘧啶代謝中丙酮酸及其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生[17]；另外，檸檬酸鹽對(duì)發(fā)酵液具有堿化作用，這起到改善微生物對(duì)逆境的耐受性；最后，檸檬酸鹽能夠加速NAD+-相關(guān)脫氫酶催化的反應(yīng)，從而形成大量NADH，NADH進(jìn)入線粒體電子傳遞鏈可以改善ATP的產(chǎn)生，加大ATP和ADP間的比值[16,18]。本研究為基于ATP代謝調(diào)控而改善SAM合成提供有力的理論依據(jù)。