氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中3種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

方志青，李婷婷，王 婭，林 野

(1 貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2 貴州省疾病預(yù)防控制中心理化科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

豆芽，又稱芽苗菜，其營(yíng)養(yǎng)豐富、美味可口且價(jià)格低廉是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｊ车氖称?，常見的有黃豆芽、綠豆芽等。豆芽的培植常使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以使豆芽粗壯無根、提高產(chǎn)量和縮短生長(zhǎng)周期，長(zhǎng)期以來被國(guó)內(nèi)外豆芽生產(chǎn)者應(yīng)用[1-3]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulator，PRGs)包括經(jīng)人工合成的對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的化合物或從生物中提取的天然植物激素，用于調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的一類農(nóng)藥[4-7]。因其在農(nóng)作物的生長(zhǎng)、開花、結(jié)果以及矮化植物、縮短水果蔬菜的成熟期等方面發(fā)揮了巨大的作用，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能夠調(diào)節(jié)果蔬生長(zhǎng)，達(dá)到增產(chǎn)、豐收等目的[8-10]。但長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人體內(nèi)分泌和代謝平衡造成影響，通常會(huì)導(dǎo)致消費(fèi)者骨質(zhì)疏松、惡性腫瘤等疾病，而且易造成兒童早熟等癥狀[11-12]。由于盲目濫用和超量使用植物生長(zhǎng)激素而造成的食品安全問題時(shí)有發(fā)生，目前是食品安全領(lǐng)域的一個(gè)重大問題。本研究針對(duì)豆芽生產(chǎn)過程中可能使用的3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，采用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)貴陽(yáng)省市售豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了殘留監(jiān)測(cè)，以期為豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量對(duì)居民健康的影響提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 樣品來源

隨機(jī)購(gòu)置于各大超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豆芽樣品合計(jì)107份，其中綠豆芽36份，黃豆芽71份。所有樣品裝入食品保鮮袋內(nèi)后-20 ℃凍藏備用。

1.2 儀器與試劑

p管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，Thermo Fisher公司)；GX-274固相萃取儀，美國(guó)吉爾森；MCS固相萃取柱(500 mg/6 mL)，Waters公司；Milli-Q AdvantageA10超純水儀，美國(guó)密理博；SIGMA3-18KS冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA；IKA MS-3漩渦混合儀，德國(guó)IKA公司；TTL-DCII型氮吹儀，北京同泰聯(lián)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Heidolph Laborota 4001 ellicient。

甲醇、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、乙腈(色譜純)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)；無水硫酸鈉、三氟化硼乙醚溶液(分析純)；4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)，分別稱取3種標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g(精確至0.0001 g)用甲醇溶解并定容至25 mL，得到1.0 mg/mL 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑儲(chǔ)備液。使用時(shí)分別吸取各儲(chǔ)備液1.0 mL甲醇定容至100 mL，得到10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，4 ℃保存。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品提取

稱取試樣10.0 g(精確至0.0001 g)于具塞離心管中，加入20.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.5%甲酸乙腈溶液，漩渦混勻2 min，超聲提取30 min，置于離心機(jī)中8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的具塞離心管中，然后加入3.00 g NaCl(使其飽和結(jié)晶)，漩渦混勻，超聲10 min，冷卻后8000 r/min離心5 min，吸出乙腈層，用無水Na2SO4脫水過濾至圓底燒瓶?jī)?nèi)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干后加入2.0 mL甲醇超聲溶解。取1.0 mL甲醇樣液加入9.0 mL 40 mmol/L HCl，超聲混勻，轉(zhuǎn)移至離心管8000 r/min離心5 min，上清液待凈化。

1.3.2 樣品凈化

取預(yù)先加5.0 mL 甲醇、5.0 mL水、5.0 mL 40 mmol/L的HCl活化的MCS柱(500 mg/6 mL)，將1.3.1中待凈化的上清液過MCS柱后收集，待樣品過柱后，用5.0 mL水淋洗除雜，真空抽干柱內(nèi)液體后加入5.0 mL甲醇洗脫收集，合并收集液于10.0 mL試管中50 ℃下用氮?dú)獯蹈纱苌?/p>

1.3.3 樣品衍生

在試管內(nèi)加入1.0 mL 10%三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混勻，70 ℃加熱衍生30 min，冷卻至室溫后加入1.0 mL乙酸乙酯/正己烷混合溶液(V/V=1:4)和2.0 mL超純水，渦旋混勻，4000 r/min離心5 min，取有機(jī)相待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

分別吸取50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1000 μL 10.0 μg/mL植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑混合使用液甲醇定容1.0 mL，參照1.3.3樣品衍生方法衍生，提取獲得0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，GC-MS/MS測(cè)定。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：TG-5MS毛細(xì)管色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，載氣：高純氦氣(≥99.99%)，柱流量：1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，柱溫：程序升溫，初始溫度80 ℃保持2 min，20 ℃/min升溫至290 ℃保持5 min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1.0 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI源，70 eV，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃，檢測(cè)方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器測(cè)定條件優(yōu)化

表1 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

圖1 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑總離子流圖(a)和二級(jí)質(zhì)譜圖(b)

為減少基質(zhì)干擾，降低檢出限，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)10.0 μg/mL 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行分析，首先通過全掃描確定4-CPA、IAA和IBA的母離子，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使各分析化合物的響應(yīng)最大化，優(yōu)化后3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的母離子、子離子及其碰撞能量見表1，總離子流圖和二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1所示。

2.2 方法的線性范圍、定量限和檢出限

以3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度(μg/mL)(x)和其定量離子峰面積(y)進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果顯示：3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在0.5～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)0.9959～0.9994(見表2)。同時(shí)，以定量離子信噪比(S/N)的3倍和10倍作為方法的檢出限和定量限，計(jì)算本方法檢出限為6.0～9.0 μg/kg、定量限為12.0～23.0 μg/kg(見表2)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

分別以回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的準(zhǔn)確度、精密度。在陰性樣品中分別按高、中、低三個(gè)不同加標(biāo)水平加入PGRs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3”樣品處理方法進(jìn)行提取、凈化和衍生后測(cè)定其含量并計(jì)算回收率。每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次加標(biāo)回收測(cè)定并計(jì)算精密度。結(jié)果表明：加標(biāo)回收率范圍在82.1%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<8%(見表3)。

表3 方法的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4 樣品檢測(cè)

采用本文建立的方法對(duì)貴陽(yáng)市市售黃豆芽、綠豆芽等107份豆芽樣品中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量進(jìn)行了測(cè)定。其中4-CPA檢出率為7.6%，含量在0.011～0.59 mg/kg范圍，IAA出率為31.2%，含量在0.01～3.36 mg/kg范圍，IBA出率為2.1%，含量在0.01～0.17 mg/kg范圍。IAA是刺激植物生長(zhǎng)發(fā)育最具代表性且最常用的內(nèi)源激素，因此解釋了IAA的檢出率最高。目前我國(guó)的國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作要求豆芽中不得檢出4-CPA、IAA、IBA等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，本研究較高的檢出率說明，市場(chǎng)上植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濫用現(xiàn)象依然存在，有待進(jìn)一步的監(jiān)管和規(guī)范。

3 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化前處理方法建立了同時(shí)測(cè)定豆芽中4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸殘留量的GC-MS/MS方法，方法在0.5～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為6.0～9.0 μg/kg、定量限為12.0～23.0 μg/kg，3個(gè)不同濃度水平下加標(biāo)回收率為82.1%～106%，能夠滿足于豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的定性和定量檢測(cè)。且應(yīng)用該方法測(cè)定了貴陽(yáng)市107份豆芽樣品中3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)定，其中IAA檢出率較高，說明市場(chǎng)上植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濫用現(xiàn)象依然存在，有待進(jìn)一步的監(jiān)管和規(guī)范。