比色法分析牛大力不同生長(zhǎng)期的多糖含量*

鐘益寧，柳 歡，吳詩(shī)云，張 焱，姚浩文，譚佩珍，劉華青，黃澤金

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299；2 防城港市萬(wàn)景林業(yè)有限公司，廣西 防城港 538021)

牛大力為豆科崖豆藤屬植物，美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspecisoaChamp.的根。具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺，強(qiáng)筋活絡(luò)等功效[1]。用于腰肌勞損，肺虛咳嗽等。主要分布在海南、福建、廣西、廣東等地，作為藥食同源植物，廣泛應(yīng)用[2-3]。研究表明，牛大力根中含多種類(lèi)型化合物，包括酚甙、黃酮類(lèi)、紫檀烷類(lèi)及多糖、氨基酸、生物堿等[4-5]。其有效成分、藥理作用及多糖含量測(cè)定已有大量報(bào)道[5-6]，多糖測(cè)定方法主要有高效液相色譜法和比色法，前者因難以獲得高純度多糖對(duì)照品而較少使用，而比色法是測(cè)量多糖的常用方法，方法簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛[6-7]。苯酚硫酸法是在硫酸催化下水解多糖，脫水生成糠醛及其衍生物，在490 nm處有最大顯色吸收，且吸光值與糖溶液濃度呈正相關(guān)，可用于多糖測(cè)定。本文用苯酚硫酸比色法對(duì)處于生長(zhǎng)期的牛大力多糖含量進(jìn)行比較分析，評(píng)價(jià)牛大力的生長(zhǎng)質(zhì)量，為林下種植牛大力藥材質(zhì)量控制提供參考依據(jù)[8-9]。

1 實(shí)驗(yàn)樣品與器材

苯酚、濃硫酸等均為分析純；牛大力為防城港林下種植藥材牛大力、巴戟天和黑老虎示范基地(2012年12月種植，分別于2015年2月、2017年10月及2019年2月三次采收)鮮牛大力，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspecisoaChamp.的根。

TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1104N電子分析天平，上海精科天平儀器廠(chǎng)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 牛大力多糖樣品制備

(1)取三批優(yōu)質(zhì)新鮮牛大力1.0 kg，切片、磨碎，用95%乙醇回流脫脂2次，過(guò)濾，沉積物按料液比1:3(g/mL)加蒸餾水，煮沸浸提3次，每次1.0 h，合并、過(guò)濾、離心(5000 r/min，10 min)，收集上層液，減壓濃縮到1/10體積，加95%乙醇，用密度計(jì)測(cè)定乙醇為80%左右，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，過(guò)濾、離心(6000 r/min，20 min)，經(jīng)凍干得粗多糖。將粗多糖用水溶解，小心滴加10%三氯乙酸去除蛋白，抽濾、離心(6000 r/min，20 min)，反復(fù)用乙醇、丙酮和乙醚交替洗滌，經(jīng)凍干得精制白色多糖，見(jiàn)表1。結(jié)果表明，隨著種植年限增加，牛大力多糖的含量增大，這可能由于糖類(lèi)化合物在植物根部不斷聚集相關(guān)，估計(jì)長(zhǎng)成后多糖含量更高。

表1 鮮牛大力多糖含量

(2)取三批新鮮牛大力1.0 kg，切片，在烘箱80 ℃烘干，恒重稱(chēng)量，粉碎成粗粉；按(1)的方法提取純化，得粗多糖和精制多糖，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，藥材干燥后，隨著種植年限增加，干藥材的質(zhì)量也增加，剔除實(shí)驗(yàn)誤差后，也顯示藥材質(zhì)量與其種植的時(shí)間成正相關(guān)，植物越老，成數(shù)也越高。

表2 干燥牛大力多糖的含量

2.2 牛大力樣品液制備

將三批鮮、干品精制多糖精確稱(chēng)取，蒸餾水定容至50 mL，搖勻得待測(cè)溶液，見(jiàn)表3。

表3 牛大力精制多糖取樣量及濃度

2.3 最大吸收波長(zhǎng)選擇

參照文獻(xiàn)[7]，用苯酚硫酸法時(shí)，在牛大力多糖與葡萄糖的最大吸收峰位490 nm處進(jìn)行測(cè)定。

2.4 對(duì)照品樣液制備

在105 ℃下烘箱中將對(duì)照品干燥至恒重，精密稱(chēng)量50 mg，置于500 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋?zhuān)?.1 mg/mL對(duì)照品液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備

精密吸取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL分置于干燥具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，精密加入5%苯酚1.0 mL，混勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，混勻，靜置10 min，然后置于40 ℃水浴中恒熱15 min，取出后迅速冷至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，在490 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(y=0.0412x+0.2816，R2=0.9993)。在2.0～16 μg/mL之間，葡萄糖濃度與吸光度呈良好線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取葡萄糖對(duì)照品及樣品溶液， 按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法重復(fù)測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)7次。對(duì)照品RSD為1.33；鮮品和干品的RSD分別為1.82和1.48(2015年批)； 2.36和1.79(2017年批)；1.66和2.13(2019年批)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取葡萄糖對(duì)照品及樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，同一樣品在不同時(shí)間測(cè)吸光度，每間隔10 min 測(cè)一次，共6 次，計(jì)算濃度。對(duì)照品RSD為1.86；鮮品和干品RSD分別為1.74和1.53(2015年批)；1.90和1.59(2017年批)；1.68和1.89(2019年批)，結(jié)果表明：對(duì)照品和樣品溶液在1 h 內(nèi)穩(wěn)定，說(shuō)明該方法在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

從三批次鮮品、干品牛大力精制多糖各精密稱(chēng)取5 份牛大力樣品，按“2.2”項(xiàng)下的樣品溶液制備方法制備樣品液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法重復(fù)測(cè)定吸光度，并計(jì)算其含量和RSD值，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，結(jié)果表明，苯酚硫酸測(cè)定法的重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取三批次鮮品、干品牛大力精制多糖6種樣品液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL各三份，加入10.0 μg/mL的葡萄糖對(duì)照品1.0 mL，加水至總體積為2.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同樣方法反應(yīng)并測(cè)其吸光度值，數(shù)據(jù)見(jiàn)表5～表7，編號(hào)1、2、3為鮮品，4、5、6為干品牛大力精制多糖供試樣品液。結(jié)果表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

表5 2015年批加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表6 2017年批加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表7 2019年批加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.10 多糖含量比較分析

表8 牛大力多糖含量測(cè)定結(jié)果

分別取0.4、0.8、1.2 mL供試樣液至10 mL 比色管中，加水至2.0 mL，另吸取蒸餾水2.0 mL 作空白對(duì)照，然后再加5%苯酚1.0 mL 及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min 后，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，取均值并按下式計(jì)算多糖含量：

多糖含量(%)=[(C×8)/V]÷1000×500÷50×100%

式中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，V是樣品體積，結(jié)果見(jiàn)表8。

結(jié)果顯示，多糖經(jīng)脫色、去蛋白等操作后，多糖含量大幅提高。說(shuō)明為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，需要進(jìn)行除雜。數(shù)據(jù)還表明，不同的種植時(shí)間和采收季節(jié)，牛大力多糖含量不同，且隨著種植年限增加，多糖含量增加，增幅較大，這可能與多糖在植物體內(nèi)不斷積聚有關(guān)。鮮品牛大力與干品有一定的差別，但不明顯，干燥品容易粉碎，處理更方便一些。

結(jié)合前面的數(shù)據(jù)，多糖含量(mg/g)=精制多糖×多糖含量均值(%)÷藥材量，經(jīng)計(jì)算鮮品多糖分別為4.04、5.10、5.79 mg/g，干品多糖含量分別為4.37、5.35、6.27 mg/g。

3 結(jié) 論

因?yàn)槎嗵侵泻兄?、蛋白質(zhì)、單糖等雜質(zhì)，使實(shí)測(cè)值偏高，因此，進(jìn)行脫脂處理很有必要，實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)脫脂、除蛋白等操作可以得到較純的精制多糖。

實(shí)驗(yàn)表明，苯酚硫酸比色法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定牛大力的多糖含量，三批牛大力鮮品的多糖含量均值分別為86.1%、87.7%、89.2%；干品為85.31%、86.4%、88.1%；鮮品多糖分別為4.04、5.10、5.79 mg/g，干品多糖含量分別為4.37、5.35、6.27 mg/g。

本文以苯酚硫酸比色法比較分析了處于生長(zhǎng)期的牛大力多糖含量，采取脫脂和去蛋白操作進(jìn)行改進(jìn)，得到較為純凈的多糖，提高了準(zhǔn)確性，為林下種植牛大力藥材的質(zhì)量控制提供理論分析依據(jù)。