鐵皮石斛類(lèi)原球莖提取物的護(hù)膚功效研究*

黃曉莉，韋 鈺，張 琪，吳 琦，田長(zhǎng)城

(蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是一種蘭科石斛屬的珍稀瀕危藥用植物，具有生津養(yǎng)胃、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤等功效[1]。由于自然繁殖率低、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等原因，鐵皮石斛的產(chǎn)量一直難以滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，縮短鐵皮石斛的生產(chǎn)周期已成為一個(gè)額待解決的問(wèn)題。

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，鐵皮石斛會(huì)產(chǎn)生一種類(lèi)似于原球莖的脫分化組織，稱(chēng)為類(lèi)原球莖或擬原球莖(protocorm-like bodies，PLBs)[2]。類(lèi)原球莖具有增殖快、生長(zhǎng)周期短的特點(diǎn)。藥物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛類(lèi)原球莖的成分與鐵皮石斛相似，含有豐富的多糖、生物堿、酚類(lèi)、氨基酸以及金屬元素[3]。毒理學(xué)研究表明鐵皮石斛類(lèi)原球莖的最大損害劑量大于5.0 g/kg，相當(dāng)于人體推薦量的300倍，是一種可利用的安全藥食資源[4]。

《本草綱目》中記載鐵皮石斛可以“長(zhǎng)肌肉，逐皮膚邪熱痱氣”，表明鐵皮石斛對(duì)皮膚疾病具有一定的防治功效。本研究分別采用冷榨、熱水浸提和乙醇浸提的方式對(duì)鐵皮石斛類(lèi)原球莖進(jìn)行提取，分析比較了不同提取物中的化學(xué)組成，并對(duì)它們的抗氧化性和抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。課題的開(kāi)展擬為鐵皮石斛類(lèi)原球莖的開(kāi)發(fā)和利用提供一定理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛類(lèi)原球莖由蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院組織培養(yǎng)獲得，選取色澤淺綠、近球狀個(gè)體為研究材料；雄性昆明種小鼠，蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心。

多酚氧化酶和Folin-Cioealteu試劑，源葉生物有限公司；熊果苷，麥克林有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；牛血清白蛋白，上海展云化工有限公司；三氯乙酸(TCA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

鐵皮石斛類(lèi)原球莖置于-20 ℃的冰箱中冷凍24 h以上，在低溫條件下粉碎成漿，8層紗布過(guò)濾，濾液在6000 rpm條件下離心10 min，取上清液。加入1%(g/mL)的活性炭顆粒，攪拌吸附60 min，微濾膜(0.45 μm)抽濾，冷凍干燥，得到鐵皮石斛類(lèi)原球莖的冷榨物(CPS)。

鐵皮石斛類(lèi)原球莖冷凍干燥后粉碎，過(guò)100目篩，按料液比1:30(g/mL)加入去離子水，在95～100 ℃水浴下攪拌浸提2 h，8層紗布過(guò)濾，6000 rpm離心10 min；上清液加入1%(g/mL)的活性炭顆粒，攪拌吸附60 min，微濾膜抽濾，真空濃縮后冷凍干燥，得到水提物(AqE)；按上述方法用95%的乙醇替代去離子水進(jìn)行回流浸提，得到鐵皮石斛類(lèi)原球莖的醇提物(AlE)。

1.2.2 提取物的組分分析

(1)總糖含量測(cè)定：利用苯酚-硫酸法測(cè)定不同樣品中的總糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品擬合回歸曲線(xiàn)[5]。

(2)蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制回歸曲線(xiàn)[6]。

(3)總酚含量測(cè)定：總酚含量的測(cè)定采用Folin-Cioealteu法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品[7]。

(4)pH值的測(cè)定：用蒸餾水配置2 mg/mL的提取物溶液，在室溫下利用pH計(jì)(雷磁PHS-25)測(cè)定溶液pH值。

1.2.3 抗氧化活性

(1)DPPH自由基的清除

參照李春陽(yáng)等[8]的方法，稍作修改，大致流程如下：準(zhǔn)確配置0.004%的DPPH-乙醇溶液，吸取2.5 mL DPPH溶液和0.5 mL 不同濃度的樣品溶液和Vc溶液，混勻后28 ℃水浴30 min，在515 nm處測(cè)定吸光度(OD樣品)。以0.5 mL蒸餾水和2.5 mL無(wú)水乙醇反應(yīng)體系為空白組(OD空白)，以0.5 mL樣品溶液和2.5 mL無(wú)水乙醇作為對(duì)照組(OD對(duì)照)。清除率按下式計(jì)算：

(2)羥基自由基的清除

參照王玲等[9]的方法，大致流程如下：依次向試管中加入1.0 mL 0.15 mmol/L FeSO4、0.4 mL 2.0 mmol/L水楊酸、0.2 mL 不同濃度的提取物溶液和1.0 mL 6.0 mmol/L H2O2，最后用蒸餾水定容至3.0 mL，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，冷卻；用蒸餾水調(diào)0，510 nm處測(cè)定吸光度(OD樣品)；空白組用蒸餾水代替樣品溶液(OD空白)，對(duì)照組用蒸餾水代替水楊酸(OD對(duì)照)。以抗壞血酸(Vc)做為陽(yáng)性對(duì)照，羥基自由基的計(jì)算如下：

(3)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制

參照鮑素華等[10]的方法，大致流程如下：小鼠處死后，摘取肝組織，制成10%的懸浮液，4000 r/min離心15 min，上清液即為肝組織勻漿液。向10.0 mL試管中依次加入0.2 mL肝組織勻漿液、0.2 mL的樣品溶液、50 μL 0.5 mmol/L FeSO4和50 μL 0.5 mmol/L Vc，對(duì)照組用生理鹽水替代肝組織勻漿，空白組則用生理鹽水替代多糖溶液。反應(yīng)液渦旋混勻后在37 ℃水浴1 h，加入2.0 mL 10%的TCA和1 mL 0.6%的TBA溶液，混勻后沸水中煮沸15 min，冰水冷卻后3000 r/min離心15 min，取上清液在532 nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算抑制率：

1.2.4 酪氨酸酶抑制活性

參照韓強(qiáng)等[11]的方法，大致步驟如下：以pH 6.8的磷酸緩沖液(50.0 mmol/L)分別配制L-多巴(0.5 mmol/L)、酪氨酸酶(40.0 μg/mL)和不同濃度的樣品溶液(0.5、1.0和2.0 mg/mL)，按表1精確吸取不同體積溶液，渦旋混勻后37 ℃水浴30 min，迅速在475 nm處測(cè)定吸光度。以熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照，酪氨酸酶抑制率按下式計(jì)算：

表1 反應(yīng)液組成

1.2.5 致敏性評(píng)價(jià)

參照2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中人體皮膚斑貼試驗(yàn)中的重復(fù)性開(kāi)放型涂抹試驗(yàn)檢測(cè)了鐵皮石斛類(lèi)原球莖不同提取物對(duì)人體皮膚不良反應(yīng)的潛在可能性。根據(jù)要求選取了30名志愿者，樣品濃度為10 mg/mL，每天2次均勻涂抹于前臂屈側(cè)，連續(xù)涂抹7天，觀察皮膚反應(yīng)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)由OriginPro 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取物的組分

以鐵皮石斛原球莖為對(duì)象，分別采用冷榨、熱水浸提和乙醇浸提的方法進(jìn)行提取，其中冷榨可以盡可能避免活性成份的失活，熱水浸提則主要針對(duì)多糖以及部分對(duì)熱不敏感小分子物質(zhì)，而醇提則主要針對(duì)弱極性的小分子物質(zhì)。研究結(jié)果表明：CPS中蛋白質(zhì)和總酚的含量均高于其他兩種提取物，同時(shí)含有較多的多糖，這表明冷榨方法較好地避免了幾種活性成分的損耗，同時(shí)由于提取條件溫和，也最大程度地保持了其結(jié)構(gòu)的完整性。蛋白質(zhì)和多糖均不溶于乙醇，所以AlE中總糖和蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CPS和AqE，但酚類(lèi)物質(zhì)較多。

表2 不同提取物的化學(xué)性質(zhì)

2.2 不同提取物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除

圖1 不同提取物的DPPH自由基清除能力

比較了不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果表明：鐵皮石斛類(lèi)原球莖的三種提取物對(duì)DPPH自由基均有著清除作用，且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，CPS和AlE提取物對(duì)DPPH自由基的清除率分別為82.6%和78.6%，高于AqE的清除率(65.2%)，這一現(xiàn)象可能緣于兩種提取物中較多的酚類(lèi)物質(zhì)。

2.2.2 羥基自由基的清除能力

羥基自由基(·OH)是活性氧類(lèi)物質(zhì)中最活潑的一種自由基，對(duì)生物體中細(xì)胞的危害極大[12]。實(shí)驗(yàn)利用Fenton反應(yīng)進(jìn)行·OH的誘導(dǎo)，進(jìn)而評(píng)價(jià)提取物對(duì)自由基的清除能力。研究結(jié)果表明：三種提取物對(duì)羥基自由基均有著顯著的清除效果，其中AqE的清除率最高，當(dāng)濃度為2.0 mg/mL時(shí)，AqE的清除率達(dá)到了85.2%。

圖2 不同提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

2.2.3 脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制

Fe2+-Vc反應(yīng)體系產(chǎn)生的自由基可以攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，生成的丙二醛(MDA)與TBA形成的復(fù)合物在532 nm處有吸收峰，吸收值越大說(shuō)明生成的MDA越多，酯質(zhì)過(guò)氧化越嚴(yán)重。由圖3可見(jiàn)，CPS和AqE對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化都呈現(xiàn)出顯著的抑制效果，而AlE的抑制效果則不是十分明顯。從組分上看，CPS和AqE中較多的多糖組分可能在抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

圖3 不同提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制

2.3 不同提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1, tyrosinase)又稱(chēng)酚氧化酶、多酚氧化酶等，是一類(lèi)含銅的氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動(dòng)植物和人體內(nèi)。酪氨酸酶能夠催化單酚羥化成二酚，再氧化成醌，最終形成黑色素[13]。一些研究發(fā)現(xiàn)，植物中的提取物對(duì)酪氨酸酶有著顯著的抑制作用，可以用來(lái)預(yù)防和治療色素沉著和黑色瘤的形成[14]。

圖4 不同提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

由圖4可見(jiàn)，CPS對(duì)酪氨酸酶活性有著較好的抑制作用，且呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系。AlE與熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的抑制相對(duì)較弱，AqE則呈現(xiàn)出對(duì)酪氨酸酶的激活作用。從結(jié)果可知，鐵皮石斛原球莖中存在抑制酪氨酸活性的物質(zhì)，但該物質(zhì)對(duì)熱敏感，加熱反應(yīng)后形成的產(chǎn)物可以激活酪氨酸酶的活性。

2.4 致敏性分析

人體皮膚斑貼試驗(yàn)顯示，三種提取物對(duì)皮膚均不具有致敏性，是十分安全的皮膚外敷材料。

表3 不同提取物的致敏性

*0：陰性反應(yīng)；1：微弱紅斑、皮膚干燥、皺褶；2：紅斑、水腫、丘疹、風(fēng)團(tuán)、脫屑、裂隙；3：明顯紅斑、水腫、水皰；4：重度紅斑、水腫、大皰、糜爛、色素沉著或色素減退、痤瘡樣改變。

3 結(jié) 論

鐵皮石斛類(lèi)原球莖中富含多種活性成分，且具有生長(zhǎng)周期短、規(guī)?；a(chǎn)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可做為野生鐵皮石斛的替代物用于工業(yè)化生產(chǎn)。研究發(fā)現(xiàn)冷榨法可以最大程度的避免鐵皮石斛類(lèi)原球莖中活性成分的流失，提取物不僅可以有效清除自由基、抑制細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí)還對(duì)酪氨酸酶的活性有著顯著的抑制作用。以上結(jié)果表明，鐵皮石斛類(lèi)原球莖中含有的活性成分對(duì)皮膚的防護(hù)、美白可能具有一定的功效，是一種頗具開(kāi)發(fā)潛力的天然資源。