南沙海區(qū)深海沉積物中細(xì)菌多樣性分析

蘇 潔，明紅霞，陳泉睿，張春鑫，關(guān)道明，樊景鳳

(1. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，大連 116023； 2. 國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，大連 116023； 3. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023)

深海是全球最大的獨立系統(tǒng)，地球表面有超過50%的面積被深海大洋所覆蓋[1]。深海沉積物是集化學(xué)物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境，同時海底沉積物還是營養(yǎng)元素進行生物地球化學(xué)循環(huán)的主要場所[2]。在深海沉積物中存在著活躍的微生物群落，負(fù)責(zé)介導(dǎo)有機碳的降解和轉(zhuǎn)化，在海洋和全球碳的生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要的作用[3]。深海沉積物中的微生物總量在全球生物量的比重已超過10%[4]。研究深海微生物多樣性不僅有利于開發(fā)利用新型微生物資源，也將為人類探索生命起源提供重要線索。隨著大洋鉆探計劃(ODP)多個航次的進行，太平洋邊緣海域沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢類群已被逐步發(fā)現(xiàn)[5-8]。然而，由于深海獨特的環(huán)境特征如低溫、高壓、缺氧等，導(dǎo)致海底99%以上的微生物無法利用現(xiàn)有技術(shù)得到分離培養(yǎng)[9]，這使得基于16S rDNA的分子生物技術(shù)成為調(diào)查海底沉積物中微生物多樣性的一種重要手段。

目前，研究學(xué)者對南沙海區(qū)表層沉積物中細(xì)菌和古菌多樣性有了一些初步的了解，但研究對象主要為可培養(yǎng)細(xì)菌[10-11]。鑒于南沙海區(qū)廣闊的水域及其多變的生境，加之以往的研究還不能全面地反映南沙海區(qū)深海沉積物中細(xì)菌資源多樣性,為探討南沙海區(qū)深海沉積物中細(xì)菌多樣性，本研究運用16S rDNA克隆文庫的方法展開對南沙海區(qū)深海沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年5月采集位于南沙群島東南海域的深海表層沉積物樣品(海水沉積物界面以下約5 cm)。采用箱式采泥器在南海3個不同站位分別采集樣品，樣品具體的信息描述如表1。

表1 南沙沉積物采樣站點及樣品描述

1.2 方法

1.2.1 沉積物細(xì)菌總DNA的提取與純化

沉積物細(xì)菌總DNA的提取參照本課題組前期建立的方法[12]。使用QIAquikPCR純化試劑盒對DNA進行純化。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴增

采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27 F和1492 R，反應(yīng)條件參照前期研究[12]。擴增產(chǎn)物用1.0%(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建及陽性克隆的篩選

采用藍白斑篩選方法篩選陽性克隆子并構(gòu)建16S rDNA克隆文庫[13]。

1.2.4 DNA序列系統(tǒng)進化分析

應(yīng)用MEGA5.0軟件，采用鄰位相接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.5 16S rDNA克隆文庫多樣性分析

采用克隆文庫的覆蓋度(Coverage)、Shannon-Wiener 指數(shù)及Simpson指數(shù)3個指標(biāo)對構(gòu)建的細(xì)菌16S rDNA克隆文庫進行多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA克隆文庫測序

對從3個深海站位沉積物樣品構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫中共獲得的565個陽性克隆子，其中NSA站位為204個陽性克隆子，NSE站位為161個陽性克隆子，NSI站位為200個陽性克隆子。對上述3個站位獲得的陽性克隆子分別進行序列測定，將序列相同的克隆子定義為一個OTU，NSA、NSE和NSI 3個站位的OTU數(shù)目分別為25、18和22。

2.2 16S rDNA克隆文庫細(xì)菌多樣性指數(shù)

本實驗采集的3個樣品均來自深海，受陸源微生物的影響較小，因而可以較準(zhǔn)確地反映出南沙海區(qū)微生物群落的多樣性。南沙海區(qū)沉積物樣品中細(xì)菌16S rDNA克隆文庫的覆蓋度都大于80%，部分接近90%，表明克隆文庫中所包含的細(xì)菌種類占沉積物樣品中全部細(xì)菌的比例已很高，庫容已經(jīng)足夠(表2)。細(xì)菌16S rDNA文庫的Shannon-Wiener指數(shù)值從高到低依次為NSI、NSA和NSE，說明3個站位中細(xì)菌多樣性程度最高的NSI站位，其次是NSA站位，較低的為NSE站位。

表2 16S rDNA克隆文庫細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.3 16S rDNA克隆文庫系統(tǒng)發(fā)育分析

對南海NSA站位沉積物中測序得到的25個OTU用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明細(xì)菌克隆文庫中的大多數(shù)序列分屬于24個類群，9個門(圖1)。而群落優(yōu)勢菌依次為變形菌、浮霉菌和放線菌。其中，南海NSA站位共獲得55個變形菌序列(27%)，浮霉菌序列共獲得32個(15.6%)，放線菌序列共有28個(13.7%)。通過與GenBank文庫的比對發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌16S rDNA克隆子的分布中變形菌門里α-Proteobacteria共有16條同源序列，3條序列是來自培養(yǎng)菌株，同源性都較高(89%～96%序列相似性)。分別是從鹽田中分離的玫瑰弧菌屬(Rhodovibrio)細(xì)菌、從土壤中分離的生絲微菌屬(Hyphomicrobium)細(xì)菌以及來自純培養(yǎng)的葉瘤桿菌科細(xì)菌Parvibaculumlavamentivorans，其余全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。γ-Proteobacteria有18條同源序列，其中有1條是來自土壤中分離的喜熱噬甲基菌屬(Methylocaldum)細(xì)菌，同源性一般(86%序列相似性)，其余17條序列全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。δ-Proteobacteria共有21條同源序列。其中2條同源序列來自可培養(yǎng)的菌株，其余的19條同源序列來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。放線菌類群共有28條同源序列，其中1條同源序列來自土壤中分離的鏈霉菌科細(xì)菌Streptacidiphilusthailandensis，同源性較低(82%序列相似性)，其余26條序列與來自卡斯卡底邊緣和Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子具有較高同源性(93%～99%序列相似性)。

NSE站位沉積物樣品中細(xì)菌克隆文庫中的大多數(shù)序列分屬于16個類群，8個門(圖2)。其中放線菌、變形菌和浮霉?fàn)罹鸀閮?yōu)勢菌。放線菌序列共獲得38個(23.6%)，變形細(xì)菌序列共獲得34個(20.4%)，浮霉菌序列共獲得27個(16.7%)。通過與GenBank文庫的序列比對發(fā)現(xiàn)，放線菌類群共有38條同源序列，其中有26條序列與來自卡斯卡底邊緣和Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子有較高的同源性 (91%～99%序列相似性)。其余全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。變形菌門中α-Proteobacteria共有10條同源序列，分別是從鹽湖中分離的硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)細(xì)菌、從土壤中分離的根瘤菌屬(Rhizobium)細(xì)菌。γ-Proteobacteria有15條同源序列，其中有6條是來自土壤中分離的草螺菌屬(Herbaspirillum)細(xì)菌，同源性較高(93%序列相似性)。δ-Proteobacteria共有9條同源序列，其中5條同源序列來自可培養(yǎng)的菌株，其余的4條同源序列來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。浮霉菌類群共有27條同源序列，全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子，其中15條同源序列分別來自日本海槽和地中海Kazan泥火山的深海冷泉沉積物，同源性較高(95%序列相似性)。

Phylogenetic tree and evolutionary distances are given by the neighbor-joining method. Numbers at each branch point indicate the percentage supported by bootstrap values based on 1000 replications. Bootstrap values>50% are shown at branching points. The same below

圖1NSA站位沉積物中細(xì)菌的16SrDNA基因序列系統(tǒng)進化分析

Figure 1 Phylogenetic analysis of the bacteria derived from sediments of NSA site according to 16S rDNA gene sequence

NSI站位站位沉積物樣品中細(xì)菌克隆文庫中的大多數(shù)序列分屬于21個類群，8個門(圖3)。其中變形菌、放線菌和浮霉?fàn)罹鸀閮?yōu)勢菌。變形細(xì)菌序列共獲得45個(22.5%)，放線菌序列共獲得36個(18%)，浮霉菌序列共有31個(15.5%)。通過與GenBank文庫的序列比對發(fā)現(xiàn)，變形菌門中α-Proteobacteria共有16條同源序列，全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。γ-Proteobacteria有21條同源序列，其中13條同源序列來自從海底淤泥中分離的脫硫桿菌屬細(xì)菌Desulfobacteriumindolicum，同源性較高(93%序列相似性)，其余8條序列全部來自巴倫支海HaakonMosby泥火山和墨西哥灣高鹽沉積物等，同源性較高(90%～97%序列相似性)。δ-Proteobacteria共有8條同源序列。其中4條同源序列來自可培養(yǎng)的菌株，其余的4條同源序列來自Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子。放線菌類群共有36條同源序列，其中有19條同源序列來自日本海槽和地中海Kazan泥火山的深海冷泉沉積物，同源性較高(96%序列相似性)，有6條同源序列來自卡斯卡底邊緣深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子。浮霉?fàn)罹汗灿?1條同源序列，全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子，其中15條同源序列分別來自卡斯卡底邊緣和Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子，同源性都極高(93%～96%序列相似性)。

圖2 NSE站位沉積物中細(xì)菌的16S rDNA基因序列系統(tǒng)進化分析

3 討論

在本實驗所選取的各站位深海沉積物中，廣泛存在的主要優(yōu)勢細(xì)菌類群均包括變形菌類群、浮霉菌類群和放線菌類群。其中，本研究中構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫涵蓋了變形菌門中α-Proteobacteria(31.3%)、δ-Proteobacteria(40.3%)和γ-Proteobacteria (28.4%)3個亞門。可見，δ-Proteobacteria為優(yōu)勢亞群，這與南海西沙海槽沉積物中的結(jié)果一致[14]。然而在陸地土壤及海水環(huán)境中占優(yōu)勢的α-Proteobacteria在本研究中也占到了很高的比例，這與前期研究結(jié)果有較大差異[15]。但也有文獻報道，α-Proteobacteria被發(fā)現(xiàn)為日本深海沉積物中的第二大優(yōu)勢類群[16]。深海環(huán)境中的優(yōu)勢類群γ-Proteobacteria，在本研究中也被證實為南沙海區(qū)深海沉積物中的第三大優(yōu)勢類群。此外，本文從3個深海站位沉積物樣品中測序獲得的16S rDNA序列中變形菌的優(yōu)勢亞群也有所不同，這些研究結(jié)果的差異主要是由于地理環(huán)境或氣候環(huán)境不同所導(dǎo)致，而且即使在相近地點菌群也會有所差異。在本研究中，放線菌為另一優(yōu)勢類群，說明放線菌在深海沉積物中的豐度較高，這也與南海其他海區(qū)沉積物中的報道相一致[17-19]。除上述幾種優(yōu)勢類群外，浮霉菌在本研究的細(xì)菌類群中也占到很大比例，這與孫慧敏等[1]在南海北部巴士海峽深海沉積物研究中的結(jié)果相一致。研究顯示，該類群一般較多分布在淺海沉積物中，分析可能的原因為淺海來源的細(xì)菌由于物理遷移(風(fēng)、潮汐等)等影響在深海海區(qū)沉積下來，并形成其優(yōu)勢菌。另外，我們從南沙海區(qū)獲得的少數(shù)16S rDNA序列與發(fā)表在基因庫中的16S rDNA序列表現(xiàn)出一定的差異，這一結(jié)果一方面說明細(xì)菌文庫的多樣性比較高；另一方面表明南沙海區(qū)仍存在一些未知種群。因此，研究中國南沙海區(qū)沉積物細(xì)菌的多樣性，將進一步豐富對海洋細(xì)菌多樣性的認(rèn)識，為我們探究南海的細(xì)菌資源奠定基礎(chǔ)。

圖3 NSI站位沉積物中細(xì)菌的16S rDNA基因序列系統(tǒng)進化分析