高效液相色譜法測(cè)定過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽的含量

趙 威，徐振興，吳月敏，吳麗艷，于思婷，徐二華，王 效

（1.杭州康德權(quán)飼料有限公司，杭州 311107; 2.包膜飼料添加劑省級(jí)重點(diǎn)企業(yè)研究院，杭州 311107）

賴氨酸作為“第一缺乏氨基酸”，在生物體內(nèi)的代謝起著重要的作用，而被廣泛用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)。飼料中添加賴氨酸可提高蛋白質(zhì)的利用率，強(qiáng)化飼料營(yíng)養(yǎng)，易于動(dòng)物消化吸收，增加料肉比[1]。由于賴氨酸易吸潮，因而在實(shí)際生產(chǎn)中都以賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽形式加以利用，以便于貯存、運(yùn)輸與使用。

反芻動(dòng)物同樣需要賴氨酸，若直接添加晶體氨基酸，在瘤胃內(nèi)會(huì)發(fā)生脫氨基作用達(dá)不到添加效果，而且會(huì)增加糞氮、尿氮排放[2]。若將氨基酸包膜，使氨基酸能通過(guò)瘤胃不被破壞，不僅能提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能，還能降低日糧蛋白水平，減少糞氮、尿氮排放，提高生產(chǎn)效益。

目前賴氨酸鹽酸鹽的檢測(cè)方法有高氯酸滴定法[3，4]、凱氏定氮法、甲醛加入滴定法[5]及衍生法液相色譜測(cè)定等方法[6]。在我國(guó)，現(xiàn)行的行業(yè)和國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（NY39－87和GB10794－2009），所采用的方法是非水滴定法，其中用到的試劑有：高氯酸滴定液、冰醋酸溶液、乙酸汞溶液，上述試劑或腐蝕性強(qiáng)，或?yàn)閯《驹噭?，不但不易獲得而且其操作對(duì)環(huán)境不友好，不利于大批量產(chǎn)品的質(zhì)量控制。而液相色譜檢測(cè)方法能進(jìn)行批量檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，樣品為色譜分離檢測(cè)，相比滴定法所受的干擾較小。本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽含量的方法，為過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

賽默飛 U3000高效液相色譜儀（備有紫外檢測(cè)器）；變色龍6.8色譜工作站。

L-賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（MACKLIN，批號(hào)：C10429138）；過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品（杭州康德權(quán)飼料有限公司提供，批號(hào)為190516、190518、190520）。

2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Agela Technologies，Venusil MP C18（4.6×150mm,5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶0.017mol/L庚烷磺酸鈉溶液（取1.7g庚烷磺酸鈉置于500mL量瓶中，加入0.1mLH3PO4，用純水稀釋并定容至刻度）=15:85，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)195nm；流速1mL/min。此色譜條件下，由賴氨酸鹽酸鹽對(duì)照品溶液和供試品溶液分析可知，出峰時(shí)間一致，均為3.68min，且溶劑無(wú)干擾。

在上述色譜條件下分別取對(duì)照品溶液、供試樣品溶液和陰性對(duì)照溶液各20μL進(jìn)樣分析，結(jié)果表明：理論板數(shù)按賴氨酸鹽酸鹽計(jì)算不低于4000，色譜峰分離度良好。對(duì)照品、供試樣品和陰性對(duì)照溶液色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品、供試樣品和陰性對(duì)照溶液色譜圖

3 方法與結(jié)果

3．1 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱取對(duì)照品賴氨酸鹽酸鹽0.25g，置100mL量瓶中，加超純水約20mL溶解，用超純水定容至刻度，搖勻，制每1mL含賴氨酸鹽酸鹽約2.5mg的對(duì)照品溶液。

供試樣品溶液：稱取50%過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品約0.1g，精密稱定，置于100mL容量瓶中，加超純水約50mL，置于100℃沸水中水浴煮沸約5min，取出放冷至室溫，加超純水定容至刻度，搖勻，備用。

3．2 線性關(guān)系考察

分別精密量取賴氨酸鹽酸鹽對(duì)照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，分別置于10mL量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，分別得賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.025、0.125、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg/mL的溶液，分別進(jìn)樣20μL測(cè)定。以對(duì)照品溶液濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，賴氨酸鹽酸鹽回歸曲線方程為：Y=22.663X+0.1964（r2=0.9997）。賴氨酸鹽酸鹽在0.025～1.25mg/mL范圍內(nèi)，與峰面積成良好線性關(guān)系。

3．3 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD結(jié)果為：0.06%。

3．4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的50%過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽6份，批號(hào)為190516，每份取樣品約0.1g，精密稱定，按3.1方法操作。在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果賴氨酸鹽酸鹽的平均含量為50.52%，RSD為0.03%，表明重復(fù)性良好。

3．5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12h，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算賴氨酸鹽酸鹽峰面積的RSD，結(jié)果為0.35%。結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3．6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽9份，批號(hào)為190516，每份取粉末約0.1g，精密稱定，分別精密加入低、中、高3種濃度的對(duì)照品溶液，同上法操作，在上述色譜條件下分析，計(jì)算平均回收率。加樣回收率測(cè)定結(jié)果見表1。

3．7 樣品測(cè)定

精密稱取50%過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品約0.1g，置于100mL量瓶中，按3.1項(xiàng)下的方法操作，在上述色譜條件下對(duì)3批次過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽進(jìn)行分析，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 50%過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

3．8 檢出限與定量限

圖2 檢出限（C）、定量限（D）液相色譜圖

取賴氨酸鹽酸鹽對(duì)照品適量，加超純水溶解并稀釋制成一系列濃度的溶液，取20μL注入液相色譜儀，測(cè)得賴氨酸鹽酸鹽最小檢出限為0.25μg（S/N≥3），定量限為2.5μg（S/N≥10）。檢出限和定量限色譜圖見圖2。

3．9 方法的比較

取3批次樣品，分別采用高氯酸滴定的國(guó)標(biāo)法與本液相法檢測(cè)，結(jié)果本法含量平均值為50.42%，RSD為0.02%，高氯酸滴定法平均值為50.43%，RSD為0.05%（表3）。檢測(cè)結(jié)果表明，本法與高氯酸檢測(cè)結(jié)果一致，無(wú)顯著差異。

表3 樣品測(cè)定比較

4 討論

4．1 流動(dòng)相和波長(zhǎng)的選擇

陸淳等[7]用高效液相色譜法測(cè)定飼料級(jí)賴氨酸鹽酸鹽，以pH1.5的水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm，結(jié)果該方法在緊鄰樣品主峰前有個(gè)小的未知峰出現(xiàn)，會(huì)影響色譜峰積分，且色譜柱長(zhǎng)時(shí)間用水做流動(dòng)相對(duì)柱效也會(huì)產(chǎn)生影響。由于賴氨酸鹽酸鹽含有鹽酸根離子，故本研究的流動(dòng)相嘗試使用離子對(duì)試劑，選擇了庚烷磺酸鈉磷酸溶液和乙腈配比的流動(dòng)相；當(dāng)用紫外分光光度計(jì)對(duì)樣品溶液在190～300nm處進(jìn)行波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)波長(zhǎng)在195nm左右時(shí)有最大吸收峰，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇195nm。最終，以離子對(duì)試劑的乙腈溶液作為流動(dòng)相，在195nm的波長(zhǎng)下，樣品溶液色譜峰出峰正常，色譜峰的前后1min均無(wú)明顯未知峰出現(xiàn)，避免了干擾，提高了色譜峰積分的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

4．2 溶劑的選擇

賴氨酸鹽酸鹽易溶于水[8]，樣品溶劑分別選用了流動(dòng)相和水，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相溶解的樣品色譜圖分離不好，峰型不對(duì)稱，而直接用水溶解的樣品峰型對(duì)稱，分離效果好。故采用水作為樣品溶劑。

4．3 樣品前處理方法選擇

過(guò)瘤胃賴氨酸鹽酸鹽樣品選擇了棕櫚油為主要包膜材料，由于樣品外層包裹了一層油脂，直接超聲不能溶解樣品，故需要在沸水浴中加熱至樣品溶液中顆粒物全部融化成透明液體，大約需要2min時(shí)間。這樣賴氨酸鹽酸鹽才能充分從包膜材料中釋放出來(lái)，溶解到溶劑中，經(jīng)冷卻后定容，即可上機(jī)測(cè)定。

本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定賴氨酸鹽酸鹽的分析方法，使用的溶劑為水，方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為賴氨酸鹽酸鹽的質(zhì)量控制方法。