不同產(chǎn)地魚腥草中4種活性成分分析評(píng)價(jià)

焦金英， 姬星宇， 李自波， 李國輝， 王彥輝， 余祖功

(1.商丘美蘭生物工程有限公司，河南商丘 476000； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095； 3.河南普華基因科技有限公司，河南鄭州 450000)

魚腥草為三白草科植物蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)的新鮮全草或干燥地上部分，始載于《名醫(yī)別錄》，其后歷代本草文獻(xiàn)都有記載“以清解肺熱見長(zhǎng)，為治肺壅之要藥”[1-3]。魚腥草味辛能行散，微寒，歸肺經(jīng)，有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效，用于肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、臃腫瘡毒等病癥[4]，自古以來就被視為常用中藥之一，尤其對(duì)治療肺癰有特殊療效?！侗静萁?jīng)疏》等古籍一向認(rèn)為魚腥草是“治痰熱壅肺，發(fā)為肺癰吐膿血之要藥?！薄侗静菥V目》中認(rèn)為：魚腥草能散熱毒癰腫[5-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)上魚腥草有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、利尿止血、通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡而抗腫瘤等作用[9-10]。

魚腥草中含有黃酮類、甾醇類等多種化合物，而揮發(fā)油為其主要有效成分。有效成分為魚腥草素、葵酰乙醛、月桂醛、月桂烯、甲基正壬酮等，還包括多酚類活性成分：蕺菜堿、槲皮素、槲皮苷、綠原酸、亞油酸等[11-13]?！吨袊F藥典》2015年版二部中收錄的“魚腥草注射液”主要以魚腥草揮發(fā)油中的4-萜品醇、α-松油醇、甲基正壬酮和乙酸龍腦酯進(jìn)行質(zhì)量控制[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油中4種有效成分含量存在很大差異，因此選取貴州省、四川省、廣東省廣州市、湖北省4地的魚腥草進(jìn)行比較分析，以期為魚腥草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、資源評(píng)價(jià)及進(jìn)一步的資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和藥品 Trace1300氣相色譜儀，賽默飛世爾；BT125D電子分析天平，賽多利斯。

4-萜品醇對(duì)照品，批號(hào)：111967-201501，中國食品藥品檢定研究院；α-松油醇，批號(hào)：111859-201503，中國食品藥品檢定研究院；甲基正壬酮，純度≥99.8%，批號(hào)：110834-201603，中國食品藥品檢定研究院；乙酸龍腦酯，純度≥99.6%，批號(hào)：110759-201105，中國食品藥品檢定研究院；正己烷，色譜純，山東禹王化工公司；無水硫酸鈉，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

鮮魚腥草藥材為湖北省、四川省、貴州省、廣東省廣州市4個(gè)產(chǎn)地實(shí)地采摘。

1.2 方法

1.2.1 魚腥草揮發(fā)油提取 分別取湖北省、四川省、貴州省、廣東省廣州市4個(gè)產(chǎn)地鮮魚腥草各 2 000 g，水蒸氣蒸餾，收集初餾液2 000 mL，再進(jìn)行重蒸餾，收集重蒸餾液約1 000 mL，即得[14]。

1.2.2 供試品溶液的制備 精確量取魚腥草蒸餾液60 mL，置圓底燒瓶中，連接揮發(fā)油測(cè)定器，自測(cè)定器上端加水充滿刻度部分，加入正己烷1.0 mL，連接回流冷凝管，加熱至沸，保持微沸40 min，冷卻至室溫，分取正己烷層，加無水硫酸鈉約0.4 g，振搖，正己烷液移至2 mL量瓶中，并用正己烷適量洗滌無水硫酸鈉，洗滌液并入同一量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 甲基正壬酮對(duì)照品溶液：取甲基正壬酮對(duì)照品適量，精確稱定，加正己烷制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

混合對(duì)照品溶液：取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮適量，精確稱定，加正己烷制成每1 mL含0.25 mg的溶液。

1.2.4 GC色譜條件 色譜柱：DB-17MS毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫：初始溫度75 ℃，保持5 min，以5 ℃/min的速率升至150 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器(FID)溫度為250 ℃；流速為1 mL/min，分流進(jìn)樣，分流比：10 ∶1。理論板數(shù)按甲基正壬酮峰計(jì)算應(yīng)大于10 000。

1.2.5 專屬性考察 分別按照“1.2.2”節(jié)和“1.2.3”節(jié)的方法制備供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液；精確吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.6 線性關(guān)系考察 分別取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮對(duì)照品適量，制成終質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，取此混合對(duì)照品溶液依次倍比稀釋，分別制成質(zhì)量濃度為0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL的溶液，各取1 μL進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.2.7 精密度考察

1.2.7.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取魚腥草蒸餾液按“1.2.2”節(jié)供試品溶液的制備項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，分別注入氣相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.7.2 中間精密度試驗(yàn) 分別由3個(gè)試驗(yàn)人員，分別在3 d內(nèi)，按“1.2.2”節(jié)方法制備供試品溶液，每人重復(fù)2次，分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液于室溫下放置0、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別制備相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3個(gè)樣品。按照含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備樣品測(cè)定，記錄峰面積和色譜圖，計(jì)算回收率。

1.2.10 不同產(chǎn)地鮮魚腥草中活性成分評(píng)價(jià) 精確稱取4個(gè)產(chǎn)地的魚腥草蒸餾液60 mL各1份，按照“1.2.2”節(jié)方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”節(jié)方法制備混合對(duì)照品溶液，分別精確吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄4種活性成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，對(duì)比4個(gè)產(chǎn)地鮮魚腥草中活性成分的含量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察結(jié)果

精確吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)，各成分保留時(shí)間和分離度見表1。由圖1可見，陰性對(duì)照溶液色譜圖中未見與對(duì)照溶液色譜圖中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮相同保留時(shí)間的色譜峰，表明陰性無干擾。供試品和對(duì)照品溶液中4個(gè)成分的峰分離度良好。

表1 專屬性考察結(jié)果

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

分別取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮對(duì)照品適量，制成終質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，取此混合對(duì)照品溶液依次倍比稀釋，分別制成質(zhì)量濃度為0.75、0.38、0.19、0.09 mg/mL 的溶液，各取1 μL進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由表2、圖2可見，4種成分在0.1～1.5 mg/mL的范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好。

表2 魚腥草四種化學(xué)成分的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3 精密度考察結(jié)果

取魚腥草蒸餾液平行制備供試品溶液6份，分別取1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD，測(cè)定結(jié)果見表3。從表3可以看出，測(cè)得樣品中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮峰面積的RSD分別為0.98%、0.87%、1.83%、1.01%，表明本試驗(yàn)測(cè)定方法的重復(fù)性良好。分別由3個(gè)試驗(yàn)人員，分別在3 d內(nèi)，制備供試品溶液，每人重復(fù)2次，分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果見表4。由表4可見，測(cè)得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮峰面積的RSD分別為1.33%，1.34%，1.32%，1.36%，表明本試驗(yàn)中間精密度良好。

表3 精密度考察的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

取同一份供試品溶液于室溫下放置0、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD，計(jì)算結(jié)果見表5。從表5可以看出，不同時(shí)間點(diǎn)的4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮峰面積的RSD分別為1.35%、1.57%、1.30%、1.44%，表明供試品溶液在室溫下放置12 h穩(wěn)定。

2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

分別制備相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%的樣品，每個(gè)濃度平行3個(gè)樣品。測(cè)得峰面積，計(jì)算回收率見表6。

表5 樣品放置穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果

表6 魚腥草4種化學(xué)成分準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 不同產(chǎn)地魚腥草4種成分測(cè)定結(jié)果

精確稱取4個(gè)產(chǎn)地的的魚腥草蒸餾液60 mL各1份，制備供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜見圖3，測(cè)定4種活性成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量結(jié)果見表7。《中國獸藥典》2015年版2部規(guī)定魚腥草注射液中4-萜品醇/參照物(0.25 μg/μL)峰峰面積比值應(yīng)不得低于0.15。從表7可以看出，湖北省、四川省、貴州省3個(gè)產(chǎn)地魚腥草4-萜品醇含量均符合藥典規(guī)定。其中以湖北地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中4種成分含量較高，尤其是 4-萜品醇含量；四川地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中則甲基正壬酮含量最為突出；貴州地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中 4-萜品醇、甲基正壬酮含量較高，但α-松油醇、乙酸龍腦酯含量明顯低于其他地區(qū)；廣東廣州地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中4-萜品醇含量不符合藥典規(guī)定，但甲基正壬酮含量較高，乙酸龍腦酯含量也高于貴州地區(qū)?？偟膩碚f，以湖北、四川地區(qū)魚腥草質(zhì)量較佳，4種主要成分含量相對(duì)較高。

表7 不同產(chǎn)地魚腥草4種化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

魚腥草揮發(fā)性成分的含量與生長(zhǎng)的氣候條件和地域關(guān)系密切相關(guān)，不同產(chǎn)地魚腥草藥材揮發(fā)性成分的差別主要體現(xiàn)在物質(zhì)的相對(duì)含量上，且差別較大，且活性成分與采摘時(shí)間也有很大關(guān)系[15]。選擇品質(zhì)優(yōu)良，活性成分含量高的藥材對(duì)于藥物制劑品質(zhì)和臨床效果?！吨袊F藥典》2015年版二部收錄了魚腥草注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，魚腥草注射液應(yīng)用鮮魚腥草經(jīng)水蒸氣蒸餾獲得的蒸餾液制備而成， 其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法確定樣品中是否含有4-萜品醇、甲基正壬酮、α-松油醇，采用氣相色譜法考察4個(gè)活性成分的特征圖譜，以甲基正壬酮為參照物，以峰面積比值不低于0.15定量。

僅應(yīng)用薄層色譜法鑒別，氣相色譜法考察特征圖譜，難以精確區(qū)分不同產(chǎn)地魚腥草藥材揮發(fā)性成分的差異，因此本研究在魚腥草注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜考察方法的基礎(chǔ)上，建立了4-萜品醇、甲基正壬酮、α-松油醇、乙酸龍腦酯4種活性成分含量精密測(cè)定的氣相色譜法，選擇外標(biāo)法定量，并參照《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》相關(guān)要求對(duì)所建方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法4種活性成分色譜峰之間，與其他雜質(zhì)峰之間均能有效分離，專屬性良好；4種活性成分在0.1～1.5 mg/mL的范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系優(yōu)良；方法重復(fù)性試驗(yàn)樣品中4個(gè)成分平均RSD≤1.2%，中間精密度試驗(yàn)樣品中4個(gè)成分平均RSD≤1.3%，精密度好，回收率在80%～120%，準(zhǔn)確度高；適用于鮮魚腥草蒸餾液中4種活性成分含量的測(cè)定。對(duì)鮮魚腥草活性成分精準(zhǔn)定量，不僅能很好地表征藥材的差異性，還有助于準(zhǔn)確找到引起這種差異的特征物質(zhì)，為中藥質(zhì)量控制提供了有用的基礎(chǔ)信息。

本試驗(yàn)采用建立的方法對(duì)湖北、四川、貴州、廣東廣州地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中4種主要成分4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮的含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行了對(duì)比分析?！吨袊F藥典》2015年版二部規(guī)定魚腥草注射液中4-萜品醇/參照物(0.25 μg/μL)峰面積比值應(yīng)不得低于0.15。含量測(cè)定結(jié)果顯示，湖北、四川、貴州3個(gè)產(chǎn)地魚腥草 4- 萜品醇含量均符合藥典規(guī)定。但不同產(chǎn)地魚腥草揮發(fā)油中4種主要成分存在很大差異，其中以湖北地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中4種成分含量普遍較高，尤其是4-萜品醇含量；四川地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中則甲基正壬酮含量最為突出；貴州地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中4-萜品醇和甲基正壬酮含量較高，但α-松油醇、乙酸龍腦酯含量明顯低于其他地區(qū)；廣東廣州地區(qū)魚腥草揮發(fā)油中4-萜品醇含量不符合藥典規(guī)定，但甲基正壬酮含量較高，乙酸龍腦酯含量也高于貴州地區(qū)?？偟膩碚f，以湖北、四川地區(qū)魚腥草質(zhì)量較佳，4種主要成分含量相對(duì)較高。本研究結(jié)果為魚腥草注射液藥材選擇、魚腥草藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供了一定的參考依據(jù)。