高通量測序技術(shù)在浮游生物研究中的應(yīng)用

（廣州市刑事科學技術(shù)研究所，廣東廣州 510030）

引言

水中尸體的死因判斷常常是法醫(yī)工作中的難題，法醫(yī)工作者常采用硅藻形態(tài)學檢驗的方法來判斷其死因。傳統(tǒng)的硅藻形態(tài)學檢驗方法有強酸消化法、微波消解法、酶消化法等。其中微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯(lián)用法［1］憑借其高硅藻回收率、定性定量分析準確的優(yōu)點，在疑難案件分析中得到了廣泛應(yīng)用，但成本較高、操作復雜的特點，限制了其在公安基層單位的普及。同時，由于形態(tài)學方法對專業(yè)知識有較高的要求，常出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果，造成不良影響。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，浮游生物多樣性的研究有了新的進展。如今，以水中浮游生物的DNA標記為檢測對象，把高通量測序技術(shù)應(yīng)用到浮游生物多樣性研究中，建立了浮游生物多樣性的高效檢測技術(shù)，這種方法簡單、快捷、通量高且成本低。本文就浮游生物中藻類及細菌的高通量測序及分子生物學檢測的研究作一綜述。

1 藻類的研究

1.1 高通量測序法檢測藻類研究

硅藻屬于真核生物，科屬種類繁多，具有環(huán)境選擇性。EGI和EG2，SK1和SK2屬于硅藻葉綠素相關(guān)基因，人體組織中不存在，可用來建立浮游生物檢測方法以診斷溺死。Sumiko 發(fā)現(xiàn)編碼EG1 和EG2 相關(guān)基因可以得到五種海水硅藻屬的PCR 產(chǎn)物，而SK1 和SK2 基因只能得到部分中心硅藻綱的PCR 擴增產(chǎn)物。同時，該方法可以檢測到5mL 血液中的所含藻類。該實驗表明利用EG相關(guān)基因作為標記分子所建立的PCR 檢測方法，可以鑒別較多種類淡水的硅藻，適用于淡水溺死案件的診斷。

在浮游生物多樣性研究中，DNA 的可變區(qū)，如18S rDNA 的8 個可變區(qū)［V1-V9（不含V6）］，是標記其生物多樣性的關(guān)鍵區(qū)域，也是能反映生物生長環(huán)境的重要標記基因。Zhao利用焦磷酸（PSQ）對硅藻18S rDNA的V7區(qū)域進行測序，發(fā)現(xiàn)硅藻種群分布與其生長環(huán)境關(guān)系密切，從而為構(gòu)建一種通過研究浮游生物多樣性來推斷溺死地點提供了可能。

上述研究表明，基于18S rDNA 的V4 區(qū)、ITS、rbcl、COI等擴增子測序技術(shù)，所建立的海水及淡水微型真核浮游生物檢測方法均具有較高的靈敏性及特異性，提示檢測溺死相關(guān)浮游生物DNA的高通量測序方法具有區(qū)分不同浮游生物的能力，從而為溺死地點的推斷提供有力支持。

1.2 其他分子生物學方法檢測藻類的研究

袁健使用熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）研究東海的浮游植物，建立了三種重要赤潮藻的qPCR檢測方法，可現(xiàn)場對東海赤潮藻進行物種分析及數(shù)量推斷。此法靈敏性和特異性較高，耗時較短，但較高的成本、引物與探針的特異性則限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。Nübel采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）檢測浮游生物16S rRNA片段以進行種群鑒定和群落分析，其擴增產(chǎn)物多態(tài)性信息豐度較高，適用于浮游生物種群分析。該法相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學方法具有快速、準確的特點，然而復雜的實驗流程、較高的成本和較低的覆蓋度則限制了此技術(shù)的進一步發(fā)展。

2 細菌的研究

2.1 16S rDNA擴增子測序分析浮游細菌的研究

氣單胞菌、發(fā)光桿菌、弧菌屬原核生物，在自然界中分布廣泛。同硅藻一樣，水生細菌的基因特性與其生長環(huán)境也具有一定的相關(guān)性。

陰星望、劉強基于細菌16S rDNA高通量測序技術(shù)，探討了湖泊、海洋浮游細菌及細菌群落結(jié)構(gòu)及豐度變化，發(fā)現(xiàn)高通量測序分析可以更精確地揭示水生菌群的群落結(jié)構(gòu)信息。饒靜靜選取氣溶素基因（hlyA）、溶血素基因（aerA）以及該菌屬所特有的內(nèi)參照基因16S rDNA保守區(qū)建立了嗜水氣單胞菌多重PCR檢測方法；針對唾液鏈球菌（SL1）和血鏈球菌（SN1）和嗜水氣單胞菌（AH1），Suto設(shè)計不同的引物對，建立的新型PCR方法在細菌DNA的檢測方面具有較高的特異性和靈敏性，適用于含有浮游生物較少的水中發(fā)現(xiàn)的尸體（如自來水）。麥柏盛在研究嗜水氣單胞菌（gyrB）和16Sr RNA 基因毛細管電泳檢測方法時，使用了Miwako 和饒靜靜分別報道的引物AH和Ah兩組基因，驗證了兩組的引物均有良好的特異性，適用于細菌的分類標記，且將此方法應(yīng)用于實際案例，為溺死診斷的研究提供了新方法。

2.2 其他分子生物學方法分析浮游細菌的研究

Uchiyama 采用TaqMan PCR 檢測三個海洋浮游生物細菌屬（氣單胞菌、弧菌、發(fā)光桿菌），此PCR 分子標記法比常規(guī)的PCR 法多增加了一對熒光引物，在擴增時，總熒光強度會隨著擴增產(chǎn)物的不斷增加而逐漸增強，呈現(xiàn)一種指數(shù)關(guān)系，提高了分子標記的準確性。且對其進行交叉反應(yīng)時，也表現(xiàn)出明顯的特異性。但較高的成本則限制了其大規(guī)模應(yīng)用。因此當實驗規(guī)模不大時，利用TaqMan PCR法檢測水生細菌也是可行的。

3 小結(jié)

對比上述檢測方法，對于藻類和浮游細菌基因組的種類、分布及數(shù)量檢測，高通量測序技術(shù)將每個序列與參考條形碼庫進行比較，在每次測序過程中獲得大量數(shù)據(jù)。由此可見，利用高通量測序技術(shù)進行溺死相關(guān)浮游生物檢測，具有降低成本，提高檢測效率等優(yōu)點。

4 結(jié)語

綜上，引物的設(shè)計和目的基因的選擇無疑是高通量測序過程中的關(guān)鍵點，文獻研究發(fā)現(xiàn)，在研究浮游生物多樣性時，硅藻的測序多選用18S rDNA 的V4、V9 區(qū)作為目的基因設(shè)計引物，Stoeck 發(fā)現(xiàn)V4 區(qū)在親緣關(guān)系較近的物種區(qū)分方面具有優(yōu)勢，V9區(qū)更適合挖掘生物總體信息，發(fā)現(xiàn)更多種類的物種；發(fā)光桿菌、弧菌、氣胞單菌等細菌則以16S rDNA擴增子測序為主，具有較高的特異性及穩(wěn)定性，可快速準確地確定浮游生物種屬，獲取浮游生物種群分布、群落結(jié)構(gòu)及豐度差異等大量信息。

高通量測序技術(shù)結(jié)合了分子生物學、生物信息學和統(tǒng)計學等多門學科，可構(gòu)建一種全面的溺死相關(guān)浮游生物多樣性分析方法，以期達到對浮游生物快速、準確和全面檢測的目的。盡管現(xiàn)在高通量測序技術(shù)存在著高成本的劣勢，但相信在不久的將來，憑借其準確性高、耗時較短、安全性高等優(yōu)點，高通量測序技術(shù)定會拓寬浮游生物多樣性研究的方向，為溺死診斷提供新的方法。