普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞中孕酮及脂聯(lián)素受體3甲基化的影響*

梁田田，李日恒，張愛民，鄭三龍，丁麗坤，彭鑫宇，問明，郗欣，郭劍，王偉森，李杰

（1.河北大學(xué)，河北 保定，071002；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000；3.保定淶源縣醫(yī)院，河北 淶源 074300）

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)常見的一種癌癥。2012年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)直腸癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中排第3位，女性中排第2位，死亡率高達49%[1]。

孕酮及脂聯(lián)素受體3（progestin and adipoQ receptor 3,PAQR3）參與細胞信號傳導(dǎo)、能量代謝及細胞分裂分化等多種生物學(xué)過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PAQR3在食管癌、喉鱗狀細胞癌及腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[2-4]。普魯卡因作為局部麻醉藥物對結(jié)直腸癌細胞中PAQR3基因表達的研究報道 較少。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與試劑 人結(jié)腸癌細胞株SW620、SW480、COLO205，胎牛血清（美國Gemini公司），L-15、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），普魯卡因（日本TCT公司），RT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）、EpiTect MSP 試劑盒（德國Qiagen公司），兔抗人PAQR3 抗體、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體等均購自石家莊華沃科瑞生物公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2 儀器與設(shè)備 全波長酶標(biāo)儀（美國EPOCH 基因有限公司），ChampGel 5000 全自動凝膠成像儀（中國容智創(chuàng)業(yè)），7300 實時熒光定量PCR儀、Veriti 普通PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及藥物處理 人結(jié)腸癌細胞株SW620培養(yǎng)于L-15 完全培養(yǎng)基，置于低二氧化碳CO2培養(yǎng)箱。人結(jié)腸癌細胞株SW480、COLO205培養(yǎng)于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱。將SW480細胞以5.0×105個/100 mm2的濃度接種于培養(yǎng)皿中，隨機標(biāo)記為對照組和實驗組：對照組用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，實驗組分別用0.5、1.0、2.0、5.0及10.0 mmol/L 不同濃度的普魯卡因處理細胞。普魯卡因溶于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基中，對照組和實驗組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）使用日本TaKaRa 株式會社SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，7300 實時熒光定量PCR儀進行聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列查閱文獻[5]設(shè)計PAQR3 引物，正向引物：5′-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3′；反向引物：5′-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3′，長度252 bp。內(nèi)參基因為β-actin，正向引物：5′-GTGGACAT CCGCAAAGAC-3′；反向引物：5′-AAAGGGTGTA ACGCAACTAA-3′，長度302 bp。記錄△Ct 值進行分析。

1.2.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylationspecific PCR,MSP）依據(jù)EpiTect MSP試劑盒說明書，以PAQR3 特異性甲基化及非甲基化 引物進行擴增。甲基化正向引物：5′-TTGTTGAAGA GCGCGTATTATATC-3′；反向引物：5′-TAAAAA CCCGAAAATCTACTCGTA-3′，長度109 bp。非甲 基化正向引物：5 ′ -TTGTTGAAGAGTGTGTATT ATATTGA-3′；反向引物：5′-TAAAAAACCCAAAA ATCTACTCATA-3′，產(chǎn)物長度109 bp。擴增完成后，對產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像 儀分析結(jié)果。甲基化百分比=甲基化條帶光密度值/（甲基化條帶光密度值+非甲基化條帶光密度值）×100%。

1.2.4 Western blotting 收集對照組及實驗組的細胞，按RIPA 法提取細胞總蛋白；Bradford 法測定蛋白濃度，定量上樣后電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h。加入一抗，4℃過夜，TTBS 漂洗，二抗37℃孵育1 h，TTBS 漂洗，ECL 發(fā)光，C-DIGIT 印跡掃描器掃描，Image Studio Didits 系統(tǒng)分析。

1.2.5 藥物處理及MSP 將結(jié)腸癌細胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，2 mmol/L 普魯卡因處理細胞24 h后，進行MSP 反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法；計數(shù)資料以百分比（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAQR3 mRNA在結(jié)腸癌細胞株中的表達

RT-PCR 結(jié)果顯示，PAQR3在結(jié)腸癌細胞株中呈低表達。3種結(jié)腸癌細胞株中（SW480、COLO205及SW620）PAQR3 mRNA分 別 為（7.68±0.20）、（8.62±0.37）和（14.14±0.56），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=458.391，P=0.000），SW620表達量高于COLO205和SW480（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同結(jié)腸癌細胞中PAQR3 mRNA的表達（±s）

2.2 PAQR3基因啟動子在結(jié)直腸癌細胞株中的甲基化程度

MSP 檢測結(jié)果顯示，SW480、COLO205及SW620細胞株可見甲基化特異性擴增產(chǎn)物條帶（見圖2）。SW480、COLO205及SW620細胞株甲基化條帶光密度值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SW480、COLO205及SW620 細 胞 株 中PAQR3基因甲基化百分比比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SW480和COLO205細胞中PAQR3甲基化百分比較SW620細胞低（P＜0.05）。見表1。

圖2 PAQR3基因啟動子甲基化狀態(tài)

表1 3種結(jié)腸癌細胞株中PAQR3基因甲基化比較

2.3 普魯卡因處理后3種結(jié)直腸癌細胞株中PAQR3甲基化程度

MSP 顯示，SW480、COLO205及SW620細胞株可見甲基化特異性擴增產(chǎn)物條帶和非甲基化特異性擴增條帶（見圖3）。普魯卡因處理后，對照組和實驗組3種細胞株中PAQR3甲基化百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組較對照組PAQR3甲基化百分比降低（P＜0.05）。見表2。

圖3 對照組和實驗組PAQR3基因啟動子甲基化狀態(tài)

表2 對照組與實驗組3種細胞中PAQR3甲基化 比較 %

2.4 不同濃度普魯卡因處理SW480細胞后PAQR3 蛋白的表達

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，各組PAQR3 蛋白表達情況（見圖4）。對照組、0.5 mmol/L 實驗組、1 mmol/L 實驗組、2 mmol/L 實驗組、5 mmol/L實驗組及10 mmol/L 實驗組結(jié)腸癌細胞中PAQR3 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，實驗組中PAQR3 蛋白相對表達量增加（P＜0.05）。見表3。

圖4 普魯卡因?qū)AQR3 蛋白表達的影響（±s）

表3 各組細胞中PAQR3 蛋白相對表達量比較（n =3，±s）

表3 各組細胞中PAQR3 蛋白相對表達量比較（n =3，±s）

組別 PAQR3 蛋白對照組 0.217±0.032 0.5 mmol/L 實驗組 0.350±0.060 1.0 mmol/L 實驗組 0.533±0.061 2.0 mmol/L 實驗組 1.240±0.120 5.0 mmol/L 實驗組 0.753±0.130 10.0 mmol/L 實驗組 0.620±0.085 F 值 49.424 P 值 0.000

3 討論

近年來，基因甲基化的研究成為熱點。SHALABY等[6]發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者血液和組織中MGMT和ERCC1甲基化頻率高于良性腫瘤者，且MGMT和ERCC1基因甲基化與其mRNA表達下調(diào)有關(guān)。KATZENMAIER等[7]分析9種大腸癌細胞系中調(diào)控半乳糖凝集素表達的表觀遺傳學(xué)機制，發(fā)現(xiàn)在未分化的大腸癌細胞系中半乳糖凝集素-12的表達缺失和其啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)。此外，國內(nèi)學(xué)者通過檢測結(jié)腸癌組織中SFRP2啟動子甲基化狀態(tài)，也證實啟動子CpG位點甲基化水平與結(jié)直腸癌的臨床及病理特點有相關(guān)性[8]。國內(nèi)外學(xué)者的研究都證實，基因甲基化在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起重要作用。

PAQR3在多種腫瘤組織及細胞中表達降低，而過表達則可抑制腫瘤細胞的侵襲表型，提示PAQR3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用[2-4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PAQR3在前列腺癌、乳腺癌等腫瘤組織出現(xiàn)基因甲基化，而這可能與PAQR3表達沉默相 關(guān)[9-10]。本實驗組前期檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中PAQR3的表達水平及甲基化狀態(tài)[5]，與上述研究結(jié)論一致[9-10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，PAQR3在3種結(jié)直腸癌細胞株中呈低表達狀態(tài)；在3種結(jié)直腸癌細胞中同樣發(fā)現(xiàn)PAQR3 呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)。隨后筆者又用普魯卡因進行逆甲基化實驗，發(fā)現(xiàn)在其濃度為2 mmol/L 時，可上調(diào)PAQR3 蛋白相對表達量。最后以最佳濃度普魯卡因處理3種結(jié)直腸癌細胞發(fā)現(xiàn)，PAQR3在3種細胞株中甲基化率降低。通過實驗筆者發(fā)現(xiàn)，PAQR3甲基化是其在結(jié)直腸癌中表達沉默的重要因素，而普魯卡因可以逆轉(zhuǎn)甲基化，上調(diào)結(jié)直腸癌細胞株中PAQR3蛋白相對表達。

綜上所述，PAQR3甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。而普魯卡因可以逆轉(zhuǎn)PAQR3甲基化，上調(diào)PAQR3 蛋白的表達。