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    血管活性腸肽在單眼視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中的表達(dá)*

    2020-03-11 09:13:30
    關(guān)鍵詞:幼貓弱視右眼

    (川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科,四川 南充 637100)

    弱視是造成全世界兒童視力下降的主要疾病之一。近些年來,隨著分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等多學(xué)科在弱視研究上的廣泛應(yīng)用,其發(fā)病機(jī)制得到進(jìn)一步揭示。目前,已知弱視的發(fā)生、發(fā)展主要與視覺神經(jīng)系統(tǒng)(主要包括視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體及視皮層)的異常改變緊密相關(guān)。弱視患者的視網(wǎng)膜和視皮層中多種神經(jīng)遞質(zhì)的含量改變,如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、營養(yǎng)神經(jīng)素及多巴胺等。血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)作為一種神經(jīng)遞質(zhì),由28個氨基酸殘基組成,屬于分泌素-胰高血糖素家族,廣泛分布于中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中,隨后被發(fā)現(xiàn)也存在外側(cè)膝狀體中[1]。早前有研究表明,視覺剝奪性弱視幼貓視皮層17區(qū)的VIP 含量減少,但在外側(cè)膝狀體中的變化還未探究[2]。本實驗通過觀察視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中VIP的表達(dá),探討VIP 對視覺發(fā)育的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 健康3周齡幼貓30只(由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供),雌雄、毛色不分,體重約290 ~360 g。排除屈光介質(zhì)混濁及眼底異常,經(jīng)檢測所有幼貓屈光度約+1.0 ~+2.0D。飼養(yǎng)在光照充足環(huán)境中,室內(nèi)溫度維持在(27±1)℃。5周齡前幼貓不能自主攝取固態(tài)食物,每日定時喂養(yǎng)貓奶粉、飲用水共8 次。5周齡后保持室內(nèi)存放充足食物及飲用水。本研究通過川北醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)并接受全程監(jiān)督。

    1.1.2 主要試劑及儀器 檸檬酸(pH=6.0)抗原修復(fù)液(武漢Servicebio公司),VIP抗體(美國Fitzgerald公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(武漢Servicebio公司),免疫組織化學(xué)試劑盒DAB 顯色劑(武漢Servicebio公司),焦碳酸二乙酯(美國Amresco公司),兔抗地高辛抗體(美國Jackson公司),探針序列,正向引物:5’-DIGTGCATCCGAGTGGCGCTTGATTGG-DIG-3’;反向引物:5’-DIG-CTGGTTTCCATCTTTGTACC TTGCCAAGTAGTG-DIG-3’(武 漢Servicebio 公 司),動物針電極(北京高視遠(yuǎn)望科技有限責(zé)任公司),視覺電生理儀(重慶國特醫(yī)療設(shè)備有限公司),掌上離心機(jī)(武漢Servicebio公司),原位雜交用離心管(美國Axygen公司),成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動物模型復(fù)制 30只幼貓隨機(jī)分為對照組和剝奪組,每組15只。用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉剝奪組幼貓后,于右眼眶周邊對稱做4個皮膚固定縫線,每個縫線上做1個小套環(huán)(遮蓋過程中套環(huán)一直存在),使用絲線穿過小套環(huán),再穿過黑色眼罩的4個小孔,打結(jié)固定眼罩,保證眼罩不壓迫眼球。每周剪斷絲線行圖形視覺誘發(fā)電位(pattern visual evoked potential,PVEP)檢測。對所有幼貓行PVEP 檢測時,3 根動物針電極分別刺入前額正中,雙耳連線枕部正中及耳尖背部的皮下。相應(yīng)鏡片矯正屈光,調(diào)整頭位使視網(wǎng)膜后極部中央與屏幕中央在同一水平線上,PVEP 采用棋盤格反轉(zhuǎn)刺激,模式選用0.3 cpd,時間頻率為1 Hz,疊加64 次,分別測量剝奪組剝奪眼和未剝奪眼、對照組右眼。6周齡時,通過比較PVEP的P100波潛伏期及振幅,證實視覺剝奪組中單眼弱視形成。用戊巴比妥鈉深度麻醉剝奪組和對照組幼貓,分離出右側(cè)外側(cè)膝狀體,石蠟包埋切片,行免疫組織化學(xué)及原位雜交實驗研究。

    1.2.2 實驗方法 免疫組織化學(xué):石蠟切片,常規(guī)脫蠟,抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,血清封閉,分別加入一抗、二抗,DAB 顯色,復(fù)染細(xì)胞核,脫水封片,顯微鏡鏡檢,圖像采集分析陽性細(xì)胞和陽性細(xì)胞平均光密度值。原位雜交:石蠟切片,常規(guī)脫蠟,消化,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,預(yù)雜交,雜交,雜交后洗滌,滴加封閉液,滴加兔抗地高辛抗體,DAB 顯色,復(fù)染細(xì)胞核,脫水封片,顯微鏡檢,圖像采集分析陽性細(xì)胞和陽性細(xì)胞平均光密度值。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗或方差分析,進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PVEP 結(jié)果

    對照組幼貓隨著年齡增加,P100波潛伏期逐漸縮短,振幅逐漸提高。測試時控制電阻,可見各組典型PVEP 波形(見圖1)。6周齡時,對照組右眼、剝奪組右眼和剝奪組左眼潛伏期比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);剝奪組右眼較對照組右眼及剝奪組左眼的潛伏期延長(P<0.05)。對照組右眼、剝奪組右眼和剝奪組左眼振幅比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),剝奪組右眼較對照組右眼及剝奪組左眼振幅降低(P<0.05)。在進(jìn)行單眼遮蓋3周后(即6周齡時),剝奪組幼貓右眼已形成單眼視覺剝奪性弱視。見表1。

    圖1 各組幼貓PVEP 波形圖

    表1 各組P100 波潛伏期和振幅比較(n =15,±s)

    表1 各組P100 波潛伏期和振幅比較(n =15,±s)

    組別 P100 波潛伏期/ms P100 振幅/u對照組右眼 96.89±4.48 12.39±1.98剝奪組右眼 121.31±8.44 9.63±0.84剝奪組左眼 99.70±2.29 12.09±1.05 F 值 38.872 8.428 P 值 0.000 0.003

    2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

    對每張切片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析??梢妰山M幼貓外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中VIP 呈陽性表達(dá),位于細(xì)胞漿內(nèi),呈棕黃色-淡黃色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。對照組大部分呈強(qiáng)陽性,陽性細(xì)胞數(shù)較多,剝奪組大部分呈中等陽性到弱陽性,陽性細(xì)胞數(shù)較少,可見兩組VIP 蛋白表達(dá)存在差異(見圖2)。兩組陽性細(xì)胞數(shù)比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),剝奪組較對照組少。兩組陽性細(xì)胞平均光密度值比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),剝奪組較對照組低。視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中VIP 蛋白表達(dá)較正常幼貓降低。見表2。

    圖2 6周齡外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中VIP 蛋白的表達(dá)(DAB×200)

    2.3 原位雜交結(jié)果

    對每張切片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組幼貓外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中均有VIP mRNA 陽性表達(dá),位于細(xì)胞漿內(nèi),呈棕黃色-淡黃色,同時與藍(lán)染的細(xì)胞核重疊。對照組大部分呈強(qiáng)陽性,陽性細(xì)胞數(shù)較多,剝奪組大部分呈中等陽性到弱陽性,陽性細(xì)胞數(shù)較少,可見兩組VIP mRNA表達(dá)存在差異(見圖3)。兩組陽性細(xì)胞數(shù)比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),剝奪組較對照組少。兩組平均光密度值比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),剝奪組較對照組低見表3。視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中VIPmRNA 轉(zhuǎn)錄水平較正常幼貓下降。見表3。

    表2 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 免疫組織化學(xué)結(jié)果比較(n =15,±s)

    表2 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 免疫組織化學(xué)結(jié)果比較(n =15,±s)

    組別 陽性細(xì)胞數(shù)/個 光密度值對照組 121.78±13.32 4 116.47±1 122.24剝奪組 53.44±40.98 2 138.07±1 765.78 t 值 4.758 2.837 P 值 0.000 0.000

    圖3 6周齡外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中VIP mRNA的表達(dá)(DAB×200)

    表3 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 原位雜交結(jié)果比較(n =15,±s)

    表3 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 原位雜交結(jié)果比較(n =15,±s)

    組別 陽性細(xì)胞數(shù)/個 光密度值對照組 61.00±20.30 3 061.76±1 595.64剝奪組 35.00±13.40 1 307.08±623.24 t 值 3.024 2.897 P 值 0.009 0.012

    3 討論

    本實驗通過PEVP來確定剝奪組弱視的形成,然后用免疫組織化學(xué)和原位雜交來檢測VIP在外側(cè)膝狀體中的表達(dá)變化。通過實驗發(fā)現(xiàn),幼貓在視覺發(fā)育敏感期內(nèi),由于雙眼視覺信息的不對等輸入,導(dǎo)致外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)降低;而VIP表達(dá)下降又對外側(cè)膝狀體正常表達(dá)的生理功能造成負(fù)面影響,從而影響視覺發(fā)育,促進(jìn)弱視的發(fā)生、發(fā)展。

    VIP 最早于1970年由豬小腸的甲醇抽提液中經(jīng)過分離得到,其具有血管舒張活性,最初被認(rèn)為是一種候選胃腸激素。后來發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于大腦皮質(zhì)、眼內(nèi)組織中[3-6],隨后證明在外側(cè)膝狀體中也廣泛存在[1]。VIP 主要作為神經(jīng)遞質(zhì)起作用[7],能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂,增加神經(jīng)細(xì)胞突起的數(shù)量[8];同時促進(jìn)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化,提高成熟神經(jīng)元的數(shù)量[9]。VIP 還影響血漿中胰多肽、脂聯(lián)素及胰島素等代謝調(diào)節(jié)激素的表達(dá)水平,進(jìn)而影響細(xì)胞代謝[10]。以往學(xué)者認(rèn)為,外側(cè)膝狀體僅僅作為視網(wǎng)膜神經(jīng)傳遞的接受體,將來自視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維束換能后傳遞至視皮層,其并不參與視覺功能的編碼,視皮層才是弱視主要的神經(jīng)系統(tǒng)受損部位。但后來發(fā)現(xiàn)外側(cè)膝狀體并不是單純的神經(jīng)傳導(dǎo)中繼站,其參與方向性等精細(xì)視覺的形成[11]。在單眼剝奪性弱視中,與剝奪眼同側(cè)的外側(cè)膝狀體被觀察到存在神經(jīng)元活動減弱[12]和神經(jīng)元萎縮[13]的現(xiàn)象,同時經(jīng)弱視側(cè)的外側(cè)膝狀體投射到視皮層17區(qū)、18區(qū)的神經(jīng)元體積也減小[14]。而且單眼剝奪性弱視中,剝奪側(cè)的外側(cè)膝狀體中細(xì)胞大小的改變與同側(cè)視皮層第4 層中眼優(yōu)勢柱寬度的減少密切相關(guān)[15]。有研究發(fā)現(xiàn),外側(cè)膝狀體與視皮層一樣,在成年動物中仍然具有經(jīng)驗依賴的可塑性,其部分功能可以在弱視后得以恢復(fù),提示外側(cè)膝狀體在弱視治療中也應(yīng)得到重點關(guān)注[16-18]??梢娡鈧?cè)膝狀體在視覺神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中不僅有神經(jīng)傳導(dǎo)作用,還有功能編輯作用。研究異常視覺體驗對外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)的影響可以論證VIP在視覺發(fā)育中扮演的重要地位。

    對于幼貓,視覺剝奪的影響程度在出生后1個月達(dá)到峰值,到3個月齡時,視覺剝奪對視覺發(fā)育的影響幾乎為零[19]。本實驗在視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)進(jìn)行單眼視覺剝奪,通過PVEP 檢測弱視的形成,這與目前普遍認(rèn)為的弱視形成機(jī)制和診斷方式相一致。對照組右眼、剝奪組左眼與剝奪組右眼的P100波潛伏期和振幅比較有差異,說明實驗組單眼弱視已形成,其中P100波潛伏期延長更能提示視路的傳導(dǎo)存在問題;同時創(chuàng)新性的遮蓋方式降低因傳統(tǒng)眼瞼縫合而增加皮損處感染的風(fēng)險,避免定期PVEP 檢測對眼瞼皮膚的反復(fù)縫合造成諸如角膜刺激、縫線斷裂等影響測試的不良后果。

    本文分別從蛋白和基因?qū)用孀C實視覺剝奪對外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)的影響。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明,在幼貓視覺發(fā)育敏感期內(nèi)的視覺剝奪,使外側(cè)膝狀體接受視網(wǎng)膜的視覺傳入信號減弱,致使外側(cè)膝狀體中表達(dá)VIP的神經(jīng)元得不到足夠的視覺刺激信號,導(dǎo)致神經(jīng)元的功能發(fā)育異常,蛋白表達(dá)能力降低。原位雜交實驗結(jié)果則證明,視覺剝奪還影響外側(cè)膝狀體內(nèi)源性VIP的產(chǎn)生,使神經(jīng)元的細(xì)胞器編碼、加工蛋白質(zhì)的能力減弱。已知VIP 參與細(xì)胞內(nèi)一系列磷酸化偶聯(lián)反應(yīng),與受體結(jié)合后,通過環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine mono phosphate,cAMP)依賴的蛋白激酶途徑,促進(jìn)葡萄糖的磷酸化和糖原分解,增強(qiáng)神經(jīng)元的營養(yǎng)代謝。VIP 還可以促進(jìn)腺苷酸環(huán)化酶的活化從而增加cAMP的作用[20]。在大腦皮層中,VIP和去甲腎上腺素相互協(xié)同,刺激皮層中cAMP的合成;同時VIP 還加速皮層神經(jīng)元放電[21]。cAMP 作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,是參與細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能和物質(zhì)代謝的重要物質(zhì),其含量降低會影響細(xì)胞內(nèi)磷酸化等多種胞內(nèi)活動;同時VIP 缺乏導(dǎo)致視交叉上核神經(jīng)元活動節(jié)律紊亂[22]。由此推測,視覺剝奪通過影響外側(cè)膝狀體中神經(jīng)元的發(fā)育,致使VIP表達(dá)下降,而VIP 減少又使神經(jīng)元的信號通路發(fā)生障礙,細(xì)胞內(nèi)的能量代謝、糖代謝等活動均受到影響;同時神經(jīng)元間的電傳導(dǎo)受阻。所以VIP表達(dá)下降會導(dǎo)致外側(cè)膝狀體神經(jīng)元功能發(fā)育不良,而代謝異常的神經(jīng)元又影響外側(cè)膝狀體功能表達(dá),從而促進(jìn)弱視的形成。

    綜上所述,弱視的神經(jīng)系統(tǒng)病理改變也發(fā)生在外側(cè)膝狀體;VIP在視覺發(fā)育中扮演著不可或缺的角色;異常視覺體驗導(dǎo)致外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)下降是弱視的重要發(fā)病機(jī)制之一。此結(jié)果為下一步對VIP 外源性干預(yù)視覺剝奪性弱視幼貓,探索VIP 治療弱視的藥理效果提供實驗基礎(chǔ)。由于方法和實驗條件的限制,本實驗只研究VIP在外側(cè)膝狀體中表達(dá)的變化,而外側(cè)膝狀體中神經(jīng)元的微觀改變有待進(jìn)一步觀察。研究神經(jīng)元相關(guān)細(xì)胞器的變化可以進(jìn)一步明確VIP 對弱視形成的影響。

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