miR-29a在酉州烏羊不同體組織中表達(dá)特征及其在B16細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

陳燦燦 李 杰 付 琳 孫曉燕 王高富周 鵬 馬友記 任航行

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460)

酉州烏羊(Capra hircus)是重慶特有的山羊品種,該羊全身被毛為白色,皮膚、嘴、眼、鼻、陰門和肛門等處的可視黏膜均為烏色,這種表型是一類罕見的纖維色素增生(fibromelanosis)現(xiàn)象,此前僅在家禽中出現(xiàn)過。此外,酉州烏羊的肉滋補(bǔ)作用極高,是食藥兼用的優(yōu)良品種,也被稱為“藥羊”,且可作為醫(yī)學(xué)研究模型[1]。因此,對(duì)酉州烏羊這種珍稀品種資源進(jìn)行研究具有重要的意義[2]。

miRNA 是一類長度約為18 ～22 個(gè)核苷酸具有調(diào)控功能的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性[3]。miRNA 通過完全或不完全的堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合靶基因的3′-UTR 抑制靶基因的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞的分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等[4-5]。大量研究表明,在毛色形成過程中參與毛色形成的基因較多,其中起重要作用的基因主要有黑素皮質(zhì)素受體1(melanocortin 1 receptor,MC1R)[6]、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia associated transcription factor,MITF)[7]、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)家 族[8]、α-促黑素細(xì)胞激素(melanocyte stimulating hormone α,α-MSH)[9]、Agouti 信號(hào)蛋白(agouti signaling protein,Asip)[10]等,且miRNA 可能調(diào)控這些基因的表達(dá),進(jìn)而參與黑色素的合成,如miR-146 抑制色素合成基因TYRP1 的表達(dá)[11]、miR-137 抑制CKT/TYRP2 的表達(dá)[12]、miR-324-3p 和miRNA-338-3P 抑制MC1R的表達(dá)等[13-14]。通過targetscan等軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-29a-5p 與鼠灰色基因(agouti singaling protein,Asip)存在靶向調(diào)控關(guān)系。而Asip 又是經(jīng)典的生黑色素通路(KEGG:melanogenesis)中最上游的一個(gè)關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子,但Asip在不同被毛顏色的山羊組織可能存在不同的調(diào)控機(jī)制[6,15]。Asip和α-MSH基因競爭性地與黑色素細(xì)胞膜上的MC1R基因結(jié)合,引起黑色素細(xì)胞內(nèi)真黑色素、褐黑色素的比例發(fā)生變化。α-促黑素細(xì)胞激素與MC1R 結(jié)合后,毛囊黑素細(xì)胞產(chǎn)生真黑色素(黑色/棕色),這種激素與黑色素細(xì)胞膜的結(jié)合如果被Agouti基因座編碼的Agouti 信號(hào)蛋白(Asip)阻斷,則生成褐黑色素[16]。此外,miR-29a 在各種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),具有顯著的促增殖、抗凋亡的作用,推測miR-29a 很可能通過調(diào)控黑色素細(xì)胞的行為學(xué)影響山羊皮膚黑色素的合成[17-18]。本研究分析酉州烏羊miR-29a 的組織表達(dá)譜及其在成熟的商品化B16 細(xì)胞增殖與分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律,以期為明確miR-29a 在酉州烏羊各組織中的表達(dá)特性及其是否參與黑色素細(xì)胞行為學(xué)的調(diào)控提供理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

12 月齡左右酉州烏羊的各種體組織和渝東白山羊的皮膚均來自于酉陽縣酉州烏羊國家級(jí)保種場,每組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。組織采集參考趙亞運(yùn)等[19]的方法,采集后用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)水清洗,置于凍存管中,然后迅速投入液氮中,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B16 細(xì)胞由重慶市山羊工程技術(shù)研究中心保存。TRIzol Reagent 購自美國invitrogen 公司;miRcute Plus miRNA Fast-Strand cDNA Kit 與miRcute Plus miRNA qPCR Kit 購自北京TIANGEN 公司;DMEM 和RPMI 1640 培養(yǎng)基購自北京gibco 公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、馬血清(horse serum,HS)和青鏈霉素購自新西蘭HyClone 公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)miRBase 中已經(jīng)公布的羊源miR-29a(MIMAT0014967)的相關(guān)序列,進(jìn)行引物設(shè)計(jì),以U6為內(nèi)參,然后用NCBI 中的BLAST 檢測引物特異性,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Reverse Primer 為反轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶通用引物。設(shè)計(jì)的引物序列信息詳見表1。

1.3 B16 細(xì)胞增殖及分化培養(yǎng)

用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基復(fù)蘇B16 細(xì)胞,使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并按照1.0×105個(gè)·mL-1鋪板六孔板中,每個(gè)板設(shè)3 個(gè)重復(fù)。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換1 次培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞的生長狀況并拍照,取一板細(xì)胞用于提取RNA。使用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞長至70%～90%,吸棄增殖培養(yǎng)基。用含2%雙抗的磷酸鹽緩沖液清洗2～3 次,加入分化培養(yǎng)基,培養(yǎng)基成分為DMEM+2%HS+2%雙抗。分化第4 天以后,每天更換培養(yǎng)基。用Olympus IX73 熒光倒置顯微鏡(Olympus,日本)觀察細(xì)胞并拍照,每個(gè)樣品隨機(jī)拍3 個(gè)視野,比例尺為200～500 μm。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄

用液氮快速研磨組織后,按照TRIzol Reagent提取試劑盒(Inritorgen 公司,美國)的操作說明書提取各組織和細(xì)胞總RNA。提取細(xì)胞RNA 時(shí),吸棄培養(yǎng)基后,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液清洗2 ～3 次,加入TRIzol 提取RNA。使用D2000 超微量分光光度計(jì)(ThermoFisher,美國)檢測總RNA 的濃度與純度,OD 值均在1.8 ～2.0 之間。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,選擇完整性良好的RNA,將其按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA 合成試劑盒操作說明,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存?zhèn)溆?。按照體系:cDNA 1 μL、內(nèi)參引物各為0.4 μL、mix 酶5 μL、RNase ddH2O 3.2 μL,進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增,并檢測反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照miRcute Plus miRNA qPCR Kit 建議的體系,在相同條件下,對(duì)退火溫度55～65℃進(jìn)行優(yōu)化,細(xì)胞和組織均以U6 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL:2×mircute plus mirna premix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性15 min;94℃變性20 s,60℃退火34 s,共40 個(gè)循環(huán);溶解曲線分析程序:95℃變性15 s,60℃退火1 min,熒光信號(hào)采集時(shí)間為5 s。根據(jù)熒光定量所得的Ct 值,采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 22 軟件進(jìn)行單因素方差分析并檢驗(yàn)其顯著性,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。P＜0.05 表示差異顯著,P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酉州烏羊不同組織中miR-29a 的表達(dá)特性

2.1.1 miR-29a 的組織表達(dá)譜 由圖1 可知,miR-29a 在酉州烏羊不同組織中均有不同程度的表達(dá),且相對(duì)表達(dá)量存在差異,其中在大腦中的相對(duì)表達(dá)量最高,腿肌和心臟次之,在肺和皮膚中表達(dá)量最低。

圖1 miR-29a 在酉州烏羊不同組織中的表達(dá)分析Fig.1 Expression analysis of miR-29a in different tissues of Youzhou dark goats

2.1.2 miR-29a 在酉州烏羊與渝東白羊皮膚組織中的表達(dá) 由圖2 可知,miR-29a 在不同膚色羊皮膚組織中均有表達(dá),但在渝東白山羊皮膚中miR-29a 的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于酉州烏羊(P＜0.01),渝東羊皮膚中miR-29a 的相對(duì)表達(dá)量是烏羊皮膚的3.44 倍,與前期測序結(jié)果一致[20]。表明miR-29a 可能與皮膚黑色素沉積有關(guān)。

圖2 miR-29a 在酉州烏羊與渝白羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of miR-29a in skin tissues of Youzhou dark goats and Yudong white goats

2.2 miR-29a 在B16 細(xì)胞增殖階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)

B16 細(xì)胞在增殖介質(zhì)中培養(yǎng)2、4、6 和8 d 時(shí),RTqPCR 檢測發(fā)現(xiàn),miR-29a 在各時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá),且其相對(duì)表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈升高趨勢(shì)(圖3)。顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),在第0 天時(shí)B16 細(xì)胞數(shù)量較少,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰;第4 天細(xì)胞基本鋪滿整個(gè)六孔板底部,細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊,幾乎分辯不出單個(gè)細(xì)胞;到第8天時(shí),細(xì)胞成云海狀(圖4)。以上結(jié)果表明,miR-29a的遞增表達(dá)可能促進(jìn)了B16 細(xì)胞的增殖。

圖3 miR-29a 在B16 細(xì)胞增殖階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of miR-29a in the proliferation phase of B16 cells

2.3 miR-29a 在B16 細(xì)胞分化階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)

將B16 細(xì)胞在分化介質(zhì)中培養(yǎng)8 d,通過RTqPCR 分別檢測細(xì)胞分化第2、第4、第6、第8 天時(shí)miR-29a 的相對(duì)表達(dá)量(U6 為內(nèi)參),結(jié)果表明,在分化第4、第6、第8 天的B16 黑色素細(xì)胞中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05),但都極顯著低于分化第2天的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.01,圖5)。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),加入分化培養(yǎng)基后,第2 天B16 黑色素細(xì)胞數(shù)目仍持續(xù)增加,第4、第6、第8 天細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定,細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大量黑色素體,黑色素分泌量增加,相較于增殖階段細(xì)胞突觸增多且變長,細(xì)胞間通過突觸相互交聯(lián)。上述結(jié)果表明,miR-29a 的低表達(dá)可能有助于黑色素細(xì)胞的分化和黑色素生成(圖6)。

圖4 B16 黑色素細(xì)胞不同日齡的增殖結(jié)果Fig.4 Proliferation results of B16 cells at different day ages

3 討論

miR-29a 參與了多種腫瘤的發(fā)生[21-22],但目前miR-29a 在皮膚黑色素沉積方面的研究尚鮮見報(bào)道。本研究通過RT-qPCR 檢測酉州烏羊不同組織中的miR-29a 表達(dá),結(jié)果顯示,miR-29a 在酉州烏羊不同體組織中廣泛表達(dá),表明miR-29a 無組織特異性,這與王健等[23]在湖羊上研究結(jié)果基本一致。但miR-29a在酉州羊大腦中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織,一方面,可能是由于miR-29a 能夠通過靶向作用于PTEN基因促進(jìn)神經(jīng)元分化并減少神經(jīng)干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[24];另一方面,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,隨著膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別的升高,miR-29a 表達(dá)量降低[25-26]。因此在酉州烏羊健康腦組織中miR-29a 呈高表達(dá),可能會(huì)抑制腫瘤的發(fā)生[27]。此外,本研究還觀察到miR-29a 在酉州烏羊皮膚與肺中的相對(duì)表達(dá)量低于其他組織,但是渝東白羊皮膚miR-29a 相對(duì)表達(dá)量是酉州烏羊皮膚的3.44 倍,推測miR-29a 可能與皮膚黑色素沉積有關(guān)。

圖5 miR-29a 在B16 細(xì)胞分化階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of the miR-29a in differentiation stage of B16 cells

圖6 B16 細(xì)胞不同日齡分化結(jié)果Fig.6 Differentiation results of B16 cells at different day ages

大量研究表明,在癌癥組織中miR-29 均下調(diào)表達(dá)[28-29],然而在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中miR-29a 表達(dá)水平上調(diào)[24]。本研究體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在增殖條件下,B16 細(xì)胞中miR-29a 的相對(duì)表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈升高趨勢(shì),且各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異明顯,暗示miR-29a 可能與黑色素細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。在B16 細(xì)胞分化階段,miR-29a 相對(duì)表達(dá)量整體呈降低趨勢(shì),即第4、第6、第8 天的細(xì)胞中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量都極顯著低于分化第2 天,說明miR-29a 的低表達(dá)可能有助于B16 細(xì)胞分化及黑色素的生成。陳金妹等[30]研究表明,B16 細(xì)胞在RPMI-1640 培養(yǎng)基中的活力和分裂增殖能力較強(qiáng),細(xì)胞產(chǎn)生黑色素能力較弱,與本研究結(jié)果基本一致。本研究在B16 細(xì)胞增殖階段選擇使用RPMI1640 培養(yǎng)基,形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在第2 天開始出現(xiàn)樹突,但突觸較短小,第8 天有少量黑色素分泌,這可能是不同廠家或者不同批次的培養(yǎng)基成分略有差異造成的。推測miR-29a 可能通過調(diào)節(jié)ASIP 的表達(dá)來調(diào)控黑色素細(xì)胞的增殖、分化過程,進(jìn)而導(dǎo)致酉州烏羊和渝東白羊2 個(gè)品種山羊皮膚黑色素沉積存在差異。但要獲得miR-29a 參與黑色素細(xì)胞行為學(xué)調(diào)控的直接證據(jù),還需要通過建立miR-29a 的過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明,miR-29a 在酉州烏羊體內(nèi)各組織廣泛表達(dá),其中在肺和皮膚中的相對(duì)表達(dá)量最低,在大腦中相對(duì)表達(dá)量最高;渝東白羊皮膚中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量是酉州烏羊的3.44 倍。體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),miR-29a 的相對(duì)表達(dá)量隨著B16 細(xì)胞的增殖而升高,但隨著B16 細(xì)胞的分化而降低,推測miR-29a 與B16 細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān)。本研究為miR-29a 參與黑色細(xì)胞行為學(xué)的調(diào)控提供了一定的理論依據(jù)。下一步可通過構(gòu)建miR-29a 慢病毒載體并轉(zhuǎn)染B16 細(xì)胞,探究miR-29a 對(duì)B16 細(xì)胞行為學(xué)變化的影響。