三月李及其紅肉突變體Aux/IAA家族基因鑒定及分析

方智振 姜翠翠 周丹蓉 潘少霖 葉新福

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/福建省落葉果樹工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013)

生長素為植物體內(nèi)一種十分重要的激素,在果實(shí)生長發(fā)育的各個(gè)階段發(fā)揮著重要的作用[1-3]。植物中生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受Aux/IAA(Auxin/Indole-3-acetic acid)、GH3(Gretchen Hagen3)和SAUR(Small Auxin Up RNA)等一系列基因調(diào)控[4-5]。其中,Aux/IAA是一類生長素早期誘導(dǎo)表達(dá)的原初響應(yīng)基因[6],在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演著重要的角色。Aux/IAA編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核,且半衰期較短[7]。大多數(shù)Aux/IAA 蛋白質(zhì)含有4 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,分別為結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[3,8]。結(jié)構(gòu)域Ⅰ含有一個(gè)可與TOPLESS 互作的亮氨酸重復(fù)基序LxLxLx,該基序與Aux/IAA 蛋白質(zhì)的抑制活性有關(guān)[9-10];結(jié)構(gòu)域Ⅱ含有一個(gè)能夠被TIR1/AFBs 識別的GWPPV 基序,此基序與Aux/IAA蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性有關(guān)[11];結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ則負(fù)責(zé)Aux/IAA 之間或Aux/IAA 與生長素響應(yīng)因子ARF(auxin response factor)之間的互作調(diào)控[12-13]。近年來,研究表明Aux/IAA 家族基因參與植物果實(shí)生長發(fā)育。Audran-Delalande 等[14]研究發(fā)現(xiàn)抑制SlIAA9 表達(dá)可導(dǎo)致番茄單性結(jié)實(shí),而沉默SlIAA27 或SlIAA17 可使番茄果實(shí)大小、形狀和品質(zhì)發(fā)生改變[15-17]。此外,Aux/IAA 家族成員在果實(shí)成熟過程中也發(fā)揮著重要的作用[18-19]。生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)互作參與果實(shí)成熟調(diào)控,而Aux/IAA 家族基因與二者的互作有關(guān)[14,18-19]?？梢?Aux/IAA 家族基因在果實(shí)生長發(fā)育和成熟過程中扮演著多重角色。因此,系統(tǒng)地鑒定和分析Aux/IAA 家族基因,并進(jìn)一步解析Aux/IAA 家族基因在果實(shí)生長發(fā)育和成熟過程中的功能具有重要的意義。目前,已從蘋果[20]、桃[19]、番木瓜[18]和山核桃[21]等果樹中鑒定出Aux/IAA 家族基因,但對李A(yù)ux/IAA 家族基因知之甚少。

三月李(Prunus salicinaLindl.Sanyueli)是適合在我國南方地區(qū)栽培的早熟黃肉李品種。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所李育種課題組采用60Co-γ 對三月李進(jìn)行輻射誘變,獲得了一個(gè)遲熟的大果紅肉突變體[22],可作為研究果實(shí)大小、果肉顏色和果實(shí)成熟期等性狀調(diào)控機(jī)制的優(yōu)良材料,但其果實(shí)性狀變異形成的分子機(jī)制不清楚。前期研究采用RNA-Seq 對不同成熟階段的三月李及其紅肉突變體果肉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了二者果實(shí)成熟過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。本研究基于該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對李A(yù)ux/IAA 家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)與表達(dá)分析,明確該基因家族序列特征及其在三月李和紅肉突變體果實(shí)成熟過程中的表達(dá)模式,以期為Aux/IAA 家族基因在李(尤其是三月李紅肉突變體)果實(shí)成熟過程中的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及Aux/IAA 家族基因的鑒定

所用李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所李育種課題組獲得的三月李(盛花后95、105 和115 d)及其紅肉突變體(盛花后95、105、115 和125 d)的果肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。所有李果實(shí)均采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所李種質(zhì)資源圃。每個(gè)階段分別從同一棵的3 個(gè)主枝上各采10 個(gè)果,采收時(shí),選擇形狀、色澤和大小一致的果實(shí)。果實(shí)采收后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,將采自同一主枝的果實(shí)切成大小相似的小塊,混合到一起,用液氮速凍后保存于-80℃冰箱。采自3 個(gè)主枝的果實(shí)作為生物學(xué)重復(fù)。

從TAIR 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.arab idops is.org/)下載擬南芥Aux/IAA 家族基因蛋白質(zhì)序列。以擬南芥和番茄的Aux/IAA 蛋白質(zhì)序列為查詢序列,采用TBtools 的BLAST 工具從三月李及其紅肉突變體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索Aux/IAA 家族成員。同時(shí),從Pfam數(shù)據(jù)庫(http:/ /pfam.xfam.org/)下載Aux/IAA 家族的HMM 模型(PF02309),并采用HMMER 3.0 進(jìn)行Aux/IAA 家族成員的鑒定。

1.2 Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

采用ExPASy 的ProtParam 工具(https:/ /web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行PsAux/IAA 家族蛋白質(zhì)氨基酸理化性質(zhì)分析;用 subCELlular LOcalization predictor(http:/ /cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行PsAux/IAA 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)保守基序分析與多重序列比對

利用NCBI 保守結(jié)構(gòu)域在線分析工具(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)和MEME(http:/ /meme.sdsc.edu/meme/meme-in.tro.html)進(jìn)行三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域與基序分析,并采用TBtools 進(jìn)行示意圖繪制。利用DNAMAN 7 軟件進(jìn)行PsAux/IAA 的氨基酸序列比對。

1.4 三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用軟件MAGAX 采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建三月李及其紅肉突變體26 個(gè)Aux/IAA 蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹與29 個(gè)擬南芥Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap 值設(shè)置為1 000。采用在線工具iTOL(https:/ /itol.embl.de/)進(jìn)行Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)進(jìn)化樹的繪制。

1.5 三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族基因的差異表達(dá)模式分析

根據(jù)三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的FPKM 值(每百萬fragments 中來自某一基因每千堿基長度的fragments 數(shù)目),分析Aux/IAA 家族基因表達(dá)情況,每個(gè)階段的表達(dá)量值為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。表達(dá)量熱圖采用TBtools 進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族基因的鑒定及蛋白質(zhì)特性分析

為了鑒定三月李及其紅肉突變體的Aux/IAA 成員,以29 個(gè)擬南芥Aux/IAA 成員的蛋白質(zhì)序列為查詢序列,通過BLAST 搜索從三月李及其紅肉突變體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索Aux/IAA 蛋白質(zhì)。同時(shí),采用隱馬爾可夫模型進(jìn)行Aux/IAA 蛋白質(zhì)鑒定,初步鑒定出38個(gè)含有Aux/IAA 結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(表1)。隨后,去除含有ARF 家族特征結(jié)構(gòu)域B3 和ARF 的蛋白質(zhì),最后共鑒定得到26 個(gè)Aux/IAA 家族基因,根據(jù)編碼蛋白質(zhì)序列長度依次將其命名為PsIAA1 ～PsIAA26。PsIAA蛋白質(zhì)序列的長度在165～802 aa 之間,預(yù)測蛋白質(zhì)的相對分子量在18.25 ～88.60 kD 之間,等電點(diǎn)介于5.15～9.56。根據(jù)預(yù)測的理論等電點(diǎn),發(fā)現(xiàn)三月李及其紅肉突變體的Aux/IAA 成員中有14 個(gè)酸性蛋白質(zhì)和12 個(gè)堿性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)分析結(jié)果表明,除了PsIAA9、PsIAA19 和PsIAA25 為穩(wěn)定蛋白質(zhì),其他PsIAA 蛋白質(zhì)均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)平均親水系數(shù)均為負(fù)數(shù),表明26 個(gè)Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)均為親水蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明,大部分Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核,個(gè)別蛋白質(zhì)位于線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)。

表1 三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位Table 1 Physicochemical properties and subcellular localization of Aux/IAA family proteins from Sanyueli and the red-fleshed mutant

2.2 三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)進(jìn)化分析

由圖1 可知,李、桃、番茄和擬南芥Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)可分為兩組(A 和B),分別包含5 個(gè)(A1 ～A5)和4 個(gè)(B1～B4)亞組,且每個(gè)桃Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)都有與其配對的李同源序列。A1 亞組的Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)數(shù)量最多,共有6 個(gè),分別為PsIAA19、PsIAA20、PsIAA22、PsIAA23、PsIAA24 和PsIAA25;A2-A4、B3 和B4 亞組均含有3 個(gè)PsIAA 蛋白質(zhì),B1 和B2亞組均含有2 個(gè)PsIAA 蛋白質(zhì);A5 亞組數(shù)量最少,僅含有1 個(gè)PsIAA 蛋白質(zhì)。

2.3 三月李及其紅肉突變體Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

對PsIAA 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)24個(gè)Aux/IAA 蛋白質(zhì)均含單一的Aux/IAA 結(jié)構(gòu)域,其中PsIAA1、PsIAA2、PsIAA4 等9 個(gè)蛋白質(zhì)含有Aux/IAA超家族結(jié)構(gòu)域,僅PsIAA25 和PsIAA26 含有其他結(jié)構(gòu)域(圖2)。為了進(jìn)一步研究李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域,利用在線軟件對李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。由圖3 可知,李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)共含有4 個(gè)保守基序。A 組除了PsIAA11 存在Motif3 缺失外,其他PsIAA 蛋白質(zhì)均含有4 個(gè)基序;而B 組除了PsIAA17 和PsIAA18 含有4 個(gè)基序外,其他PsIAA蛋白質(zhì)均存在1～2 個(gè)基序的缺失。

圖1 李、桃、番茄和擬南芥Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Aux/IAA family proteins from plum,peach,tomato and Arabidopsis

圖2 李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)進(jìn)化樹及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Phylogenetic tree and conserved domain of plum Aux/IAA family

圖3 李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)保守基序及結(jié)構(gòu)域序列LogoFig.3 The conserved motifs and domain sequence Logo of plum Aux/IAA family proteins

為了分析李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的特征,采用DNAMAN7 對李A(yù)ux/IAA 進(jìn)行多重序列比對分析(圖4)。結(jié)果顯示,大部分李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)含有4 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(DomainI-DomainIV)。除了 PsIAA1、PsIAA4、PsIAA8、PsIAA9、PsIAA10、PsIAA18、PsIAA21 和PsIAA26,其他PsIAA 蛋白質(zhì)均含有經(jīng)典的LxLxLx 基序。此外,大部分李A(yù)ux/IAA家族蛋白質(zhì)都含有2 個(gè)核定位信號,分別為位于DomainⅠ和DomainⅡ之間的雙組份核定位信號以及位于DomainⅣ的SV40 核定位信號。

2.4 三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程中Aux/IAA 家族基因的表達(dá)模式分析

基于三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中26 個(gè)Aux/IAA 家族基因的FPKM 值,分析Aux/IAA 家族基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程中共有16 個(gè)Aux/IAA 家族基因(PsIAA2、PsIAA5、PsIAA6、PsIAA7、PsIAA10、PsIAA11、PsIAA13、PsIAA14、PsIAA15、PsIAA17、PsIAA18、PsIAA19、PsIAA20、PsIAA22、PsIAA23 和PsIAA25)存在差異表達(dá)(圖5)。PsIAA2、PsIAA5、PsIAA7、PsIAA11、PsIAA13、PsIAA14、PsIAA17、PsIAA22 在三月李及其紅肉突變體果肉中的表達(dá)量均隨著果實(shí)的成熟逐漸升高。其中,PsIAA11 和PsIAA13 在三月李果肉中的表達(dá)量高于紅肉突變體果肉,而PsIAA14 在紅肉突變體果肉中的表達(dá)量高于三月李果肉。PsIAA18 和PsIAA20 在三月李及其紅肉突變體果肉中的表達(dá)量均隨著果實(shí)的成熟逐漸降低。其中,PsIAA18 在紅肉突變體果肉中的表達(dá)量始終高于三月李果肉。PsIAA15、PsIAA19 和PsIAA25在成熟三月李果肉中的表達(dá)量降低,但三者在紅肉突變體果實(shí)成熟過程中的表達(dá)量無明顯變化。其中,PsIAA19 和PsIAA25 在紅肉突變體果肉中的表達(dá)量高于三月李果肉。

3 討論

生長素是與許多植物生長發(fā)育過程密切相關(guān)的重要信號分子[23]。Aux/IAA 通過與生長素響應(yīng)因子ARF 結(jié)合參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游基因表達(dá)的調(diào)控[24],進(jìn)而參與果實(shí)成熟等植物生長發(fā)育過程的調(diào)控。目前,已從包括蘋果[20]、桃[19]、番木瓜[18]和山核桃[21]等果樹在內(nèi)的多種植物中鑒定出Aux/IAA 家族基因,不同植物Aux/IAA 家族基因成員數(shù)量和組成存在一定的差異。本研究從三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程的轉(zhuǎn)錄組中鑒定出26 個(gè)Aux/IAA 家族基因,少于擬南芥(29 個(gè))[25]和蘋果(33 個(gè))[20],但多于番茄[14](25 個(gè))、桃(22 個(gè))[19]、山核桃(22 個(gè))[21]和番木瓜(18 個(gè))[18]。本研究鑒定的Aux/IAA 家族基因成員數(shù)量略多于其近緣物種桃,且進(jìn)化樹分析顯示,22個(gè)桃Aux/IAA 家族蛋白質(zhì)都可在李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)中找到同源序列,可見鑒定的Aux/IAA 家族基因成員具有較高的完整性,但三月李基因組中Aux/IAA家族基因成員的準(zhǔn)確數(shù)量還需通過基因組數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步確定。

圖4 李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)的多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment analysis of plum Aux/IAA family proteins

圖5 李A(yù)ux/IAA 家族基因在三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程中的表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of plum Aux/IAAfamily genes during fruit ripening of Sanyueli and the red-fleshed mutant

Aux/IAA 是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Aux/IAA 通過對不同濃度生長素的響應(yīng),與生長素響應(yīng)因子ARF 互作抑制或激活生長素響應(yīng)基因的表達(dá),參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[26]。在低生長素濃度條件下,Aux/IAA 蛋白質(zhì)與ARF 結(jié)合抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄[27-28];在高生長素濃度條件下,Aux/IAA 被降解[26,29]。Aux/IAA 蛋白質(zhì)通過4 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用。結(jié)構(gòu)域Ⅰ決定Aux/IAA 蛋白質(zhì)的抑制活性[9]。結(jié)構(gòu)域Ⅱ則為Aux/IAA 蛋白質(zhì)與F-盒蛋白質(zhì)TIR1的互作位點(diǎn),負(fù)責(zé)參與Aux/IAA 降解的調(diào)控[11]。結(jié)構(gòu)域Ⅱ的缺失可導(dǎo)致生長素濃度提高時(shí)Aux/IAA 蛋白質(zhì)無法被快速降解,使其半衰期延長,降低對生長素的靈敏度[30-31]。結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ是調(diào)控Aux/IAA 與Aux/IAA 或ARF 結(jié)合形成聚合體的位點(diǎn)[12-13]。本研究鑒定的多個(gè)Aux/IAA 蛋白質(zhì)存在位點(diǎn)的缺失或突變。番茄[14]、番木瓜[18]、桃[19]、蘋果[20]和山核桃[21]等植物的Aux/IAA 家族蛋白中也發(fā)現(xiàn)了功能位點(diǎn)的缺失或突變。這些位點(diǎn)的缺失或突變均有可能引起Aux/IAA 蛋白質(zhì)功能的改變,但這些功能位點(diǎn)的缺失或突變對Aux/IAA 蛋白質(zhì)功能的影響鮮見報(bào)道。因此,推測這些存在結(jié)構(gòu)域缺失的李A(yù)ux/IAA 蛋白質(zhì)可能不參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能發(fā)生改變,但具體功能還需通過試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明,在三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程中共有16 個(gè)差異表達(dá)Aux/IAA 家族基因,說明Aux/IAA 家族基因與李果實(shí)成熟過程中密切相關(guān)。桃[19]和番木瓜[18]的研究中也發(fā)現(xiàn)在果實(shí)成熟過程Aux/IAA 家族基因的表達(dá)存在活躍的變化。Bassa等[15]研究發(fā)現(xiàn)沉默SlIAA27 可使轉(zhuǎn)基因株系的果實(shí)顯著變小。本研究中,PsIAA19、PsIAA20、PsIAA25 與SlIAA27 蛋白質(zhì)屬于同一個(gè)分支,表明它們可能具有類似的功能。前期果實(shí)性狀比較表明,紅肉突變體果實(shí)明顯大于三月李果實(shí),而本研究結(jié)果顯示,三月李紅肉突變體果肉中PsIAA19 和PsIAA25 的表達(dá)量高于三月李果肉中的表達(dá)量,推測PsIAA19 和PsIAA25 可能參與果實(shí)大小調(diào)控。此外,三月李紅肉突變體果肉中PsIAA14 的表達(dá)量也高于三月李果肉中的表達(dá)量,但Su 等[16]發(fā)現(xiàn)沉默PsIAA14 同源基因SlIAA27 也可使轉(zhuǎn)基因株系的果實(shí)明顯變小。此外,PsIAA11 和PsIAA13在三月李果肉中的表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟而迅速上升,但在紅肉突變體果肉中的表達(dá)量始終維持在很低的水平。這兩個(gè)基因在三月李及其紅肉突變體果肉中表達(dá)模式的差異是否與其果實(shí)成熟期和果肉顏色變異有關(guān)及差異表達(dá)的形成機(jī)制還有待探討。

4 結(jié)論

本研究基于三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),鑒定出26 個(gè)Aux/IAA 家族基因。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)可分為2個(gè)組,9 個(gè)亞組。結(jié)構(gòu)域預(yù)測和多序列比對結(jié)果顯示,李A(yù)ux/IAA 家族蛋白質(zhì)具有保守的特征結(jié)構(gòu)域;亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明,大部分李A(yù)ux/IAA 蛋白質(zhì)分布于細(xì)胞核。此外,在三月李及其紅肉突變體果實(shí)成熟過程中共有16 個(gè)Aux/IAA基因存在差異表達(dá),且不同成員呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。本研究結(jié)果可為李A(yù)ux/IAA家族基因在果實(shí)成熟過程的功能研究提供參考。