酶法水解脫脂乳及其對嗜熱鏈球菌增殖效果研究

杜永新，段玉霞，馬萬平，趙世偉，楊子彪

（云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司，云南大理 671003）

0 引言

脫脂乳（Skimmed milk powder，SMP） 是鮮乳通過物理方法將脂肪經(jīng)高速離心機(jī)脫去，再經(jīng)過濃縮、噴霧干燥而制成，其脂肪含量較低（≤2.0%），蛋白質(zhì)含量高（≥32%）；按照加工方式可分為低熱脫脂乳、中熱脫脂乳、高熱脫脂乳等[1]。脫脂奶粉主要用作加工其他食品的原料，或是特殊營養(yǎng)需要的消費(fèi)者食用[2]，其含有優(yōu)質(zhì)的氮源、碳源、維生素及微量元素等[3]，適合乳酸菌生長，但其凝乳性導(dǎo)致菌體不易被收集，很少用于工業(yè)發(fā)酵劑的制備。隨著蛋白酶制備技術(shù)的成熟，脫脂乳酶解液開始用于乳酸菌的培養(yǎng)，以脫脂乳酶解液作為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其活菌數(shù)比脫脂乳高，且利用此培養(yǎng)基得到的凍干發(fā)酵劑質(zhì)量也較好[4]。蛋白酶解物不僅能促進(jìn)乳酸菌的增殖[5]，還能提高乳酸菌長期保存時(shí)的生存能力[6]，且添加在發(fā)酵制品中能夠增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和風(fēng)味；脫脂乳酶解液培養(yǎng)出的乳酸菌具有安全性高、活菌數(shù)高、菌體易收集、抑菌性能強(qiáng)[7]等優(yōu)點(diǎn)，故成為研究的熱點(diǎn)。

通過研究影響脫脂乳乳蛋白酶解的工藝因素（包括酶解時(shí)間、加酶量、反應(yīng)溫度、起始pH 值），以促進(jìn)乳酸菌增殖為出發(fā)點(diǎn)探究酶解脫脂乳對嗜熱鏈球菌2017- a 的作用，進(jìn)一步擴(kuò)大脫脂乳粉的利用，以期為乳酸菌發(fā)酵劑的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

脫脂乳粉、WPC80，產(chǎn)自新西蘭；嗜熱鏈球菌，自分離菌株，云南皇氏來思爾乳業(yè)有限公司提供；中性蛋白酶（食品級，50 000 U/g）、L-Cysteine HCl，北京索萊寶科技有限公司提供；氫氧化鈉（國產(chǎn)分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；酵母粉，安琪酵母股份有限公司提供；牛肉膏、魚蛋白胨、胰蛋白胨，北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；蔗糖（國產(chǎn)分析純），江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司提供；葡萄糖、乳糖、MgSO4·7H2O、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，均為國產(chǎn)分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供。

1.2 培養(yǎng)基

M17，參考張曉蕾[8]的方法配制。

改良M17 培養(yǎng)基（1 000 mL 用量）：牛肉膏15 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，乳糖5 g，魚蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，MgSO4·7H2O 250 mg，蔗糖5 g，L-Cysteine HCl＊110 mg，WPC 80＊20.5%，黃瓜汁＊310%，磷酸氫二鈉0.02 mol/L，磷酸二氫鈉0.02 mol/L（備注：*1，*2 采用0.22 μm 無菌濾器過濾；*3 黃瓜汁的制備：選購新鮮的黃瓜，清洗、切片、稱重，然后加水打漿，紗布過濾，于115 ℃下滅菌15 min，冷卻后備用。）

按上述要求準(zhǔn)確稱取各組分，用去離子水定量到1 000 mL，于121 ℃下滅菌15 min；M17 瓊脂糖培養(yǎng)基配制：在M17 液體培養(yǎng)基組分基礎(chǔ)上加入技術(shù)瓊脂粉12 g，于121 ℃下滅菌15 min。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pH 計(jì)，METTLER TOLEDO 公司產(chǎn)品；CX41 型顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化和培養(yǎng)

凍干菌種在M17 中于38 ℃下活化2 代，待形態(tài)恢復(fù)正常后，于4 ℃下保藏，備用。

以2%（V/V） 的接種量將活化后的菌株轉(zhuǎn)接至不同水解脫脂乳培養(yǎng)液中，于38 ℃下恒溫發(fā)酵24 h，發(fā)酵過程及發(fā)酵結(jié)束后測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4.2 脫脂乳水解液的制備

（1） 稱量。準(zhǔn)確稱取脫脂乳粉12 g。

（2） 加熱。100 mL ddH2O 加熱至55～60 ℃。

（3） 溶解。將稱量好的脫脂乳粉溶于ddH2O。

（4） 定量。測定上述溶液蛋白含量，控制在3.5%～3.7%。

（5） 調(diào)pH 值。將上述定量后溶解pH 值調(diào)至7.0。

（6） 稱量。稱取中性蛋白酶，加酶量為120 U/mL。

（7） 溶解。將中性蛋白酶加入上述溶液中，充分溶解混勻。

（8） 酶解。55 ℃下酶解，酶解過程中用0.5 mol/L NaOH 中和酶解液。

（9） 滅菌（酶）。溫度115 ℃，時(shí)間10 min，滅菌結(jié)束快速冷卻。

（10） 調(diào)pH 值。將體系pH 值調(diào)至7.0。

（11） 保存。室溫或冷藏條件下保存?zhèn)溆谩Ｋ舛扔?jì)算公式：

式中：B——NaOH 體積，mL；

Mb——NaOH 濃度，mol/L；

α——氨基酸平均解離度，酪蛋白的1/α 為2.26；

Mp——蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；

Htot——對于酪蛋白，取值為8.2 mmol/g[9]。

1.4.3 活菌數(shù)測定

活菌數(shù)測定參照GB 4789.35—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》 的方法進(jìn)行[10]。

1.4.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響脫脂乳水解反應(yīng)的主要因素有酶解溫度、起始pH 值、加酶量和酶解時(shí)間。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化中性蛋白酶對脫脂乳的酶解條件。以加酶量（A）、起始pH 值（B）、酶解溫度（C） 和酶解時(shí)間（D）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4.5 不同培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌促生長對照試驗(yàn)

凍干菌活化2 代，按2%接菌量分別接種于脫脂乳酶解液培養(yǎng)基、M17 培養(yǎng)基和M17 改良培養(yǎng)基中，于38 ℃下恒溫發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束參照GB 4789.35—2016 法測定活菌數(shù)。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism7 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，并做3 個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度對水解度的影響

酶催化底物反應(yīng)的速度和酶的穩(wěn)定性均受到酶解溫度的影響。通常情況下，由于反應(yīng)底物的不同，中性蛋白酶對其最適酶解溫度也有所不同。參照說明書，中性蛋白酶的最佳酶解溫度為30～60 ℃，其最佳酶解pH 值5.5～7.5。為探究酶解溫度對中性蛋白酶酶解乳蛋白的影響，設(shè)定起始pH 值7.0，加酶量120 U/mL，酶解時(shí)間3.0 h，最終以水解度作為指標(biāo)，探究不同酶解溫度對脫脂乳乳蛋白水解度的影響規(guī)律。

酶解溫度對水解度的影響見圖1。

由圖1 可知，水解度隨著酶解溫度的升高而升高。在40～50 ℃內(nèi)水解度較在50～60 ℃反應(yīng)溫度內(nèi)上升慢，造成此現(xiàn)象主要原因是：在適宜的反應(yīng)溫度下，隨著反應(yīng)溫度的升高，加聚了反應(yīng)物分子間的接觸，使得反應(yīng)更為劇烈；在50～60 ℃內(nèi)，中性蛋白酶酶活性較強(qiáng)，在同等條件下其反應(yīng)速度就較其他反應(yīng)溫度下降快。結(jié)果表明，中性蛋白酶酶解脫脂乳乳蛋白其反應(yīng)溫度在60 ℃時(shí)效果最好，由于脫脂乳粉中含有還原糖，經(jīng)酶解后的產(chǎn)物中含有大量氨基化合物，在適宜條件下會發(fā)生美德拉反應(yīng)，使酶解物顏色加深，并且在一定范圍內(nèi)溫度對美德拉反應(yīng)有正促進(jìn)作用。為避免美拉德反應(yīng)對酶解物的影響，所以選定55 ℃最為酶解溫度。

2.2 起始pH 值對水解度的影響

由上述結(jié)果可知，中性蛋白酶在55 ℃時(shí)綜合效果較佳；在加酶量120 U/mL，酶解時(shí)間3.0 h，酶解溫度55 ℃條件下，探究不同起始pH 值對水解度的影響。

起始pH 值對水解度的影響見圖2。

由圖2 可知，中性蛋白酶的pH 值為6.0 時(shí)水解度較低；起始pH 值在6.0～7.5 內(nèi)，水解度隨起始pH值的增加而加快；當(dāng)起始pH 值超過7.5 時(shí)，水解度開始下降，并且水解液的顏色也隨之加深。由于在測定水解度過程中添加NaOH，反應(yīng)過程會產(chǎn)生的鹽，會使溶液滲透壓增大，不利于菌體生長，綜合考慮選定起始pH 值7.5 作為最佳起始pH 值。

2.3 酶解時(shí)間對水解度的影響

由上述試驗(yàn)確定的結(jié)果，設(shè)定酶解溫度55 ℃，起始pH 值7.5，在加酶量120 U/mL 下探究不同酶解時(shí)間對脫脂乳乳蛋白酶解度的影響。

酶解時(shí)間對水解度的影響見圖3。

由圖3 可知，在上述優(yōu)化酶解條件下，隨著時(shí)間的增加，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在酶解時(shí)間開始2 h 內(nèi)，水解度增加趨勢較2～3 h 內(nèi)較慢；水解3 h 后水解度呈現(xiàn)下降的趨勢；在酶解反應(yīng)開始2 h 內(nèi)底物濃度較高，在其最適宜反應(yīng)溫度和起始pH 值條件下，酶與底物濃度比高，酶活力高，反應(yīng)較快；隨著酶解時(shí)間的增加，在2～3 h 時(shí)，酶與底物濃度雖然下降，但酶活力達(dá)到最高，酶解效率最佳；在3 h 后酶與底物濃度比降低，反應(yīng)也隨之降低。為在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳酶解效果，最終選定3 h作為酶解時(shí)間。

2.4 中性蛋白酶添加量對水解度的影響

由上述試驗(yàn)確定的結(jié)果，設(shè)定酶解溫度55 ℃，起始pH 值7.5，酶解時(shí)間3 h，在加酶量分別為60，120，180，240，300 U/mL 下探究不同加酶量對水解度的影響。

加酶量對水解度的影響見圖4。

在整個(gè)酶解過程中由于底物蛋白的量是充足的，酶的添加量決定了酶與底物濃度比，故酶的添加量可以準(zhǔn)確地反映酶的反應(yīng)速率。由圖4 可知，加酶量為120～180 U/mL 時(shí)，酶的反應(yīng)速率增加較快；添加酶量超過180 U/mL 后，酶解度速緩慢。綜合考慮水解度和生產(chǎn)成本，選定加酶量為180 U/mL。

2.5 脫脂乳乳蛋白酶解條件優(yōu)化

試驗(yàn)確定了最佳單因素影響條件，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上對加酶量、起始pH 值、酶解溫度和水解時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以確定中性蛋白酶酶解脫脂乳乳蛋白的最佳工藝參數(shù)組合。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

對上述結(jié)果進(jìn)行分析可知，影響脫脂乳乳蛋白水解度的因素主次關(guān)系依次為加酶量＞起始pH 值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間。在整個(gè)酶解過程中，底物蛋白是絕對夠量的，也就是說乳蛋白的酶解程度主要取決于酶的添加量，其次是起始pH 值，最后是酶解溫度和酶解時(shí)間。由試驗(yàn)結(jié)果和正交分析可知，乳蛋白最佳酶解條件組合為A3B1C2D1，所以最終選定酶解脫脂乳乳蛋白工藝為中性蛋白酶添加量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，起始pH 值6.5，酶解時(shí)間2 h。

2.6 不同水解度脫脂乳對嗜熱鏈球菌2017-a 的促生長作用情況

經(jīng)酶解后的脫脂乳富含大量的生物活性物質(zhì)，可促進(jìn)益生菌的生長。為探究酶解脫脂乳對嗜熱鏈球菌2017-a 的促生長作用，以便于生產(chǎn)應(yīng)用，分別將脫脂乳在優(yōu)化酶解條件下分別酶解時(shí)間0.5，1.0，1.5，2.0 h，水解結(jié)束經(jīng)滅菌（酶） 處理作為培養(yǎng)基，同時(shí)以不同培養(yǎng)基為參照，以活菌數(shù)作為指標(biāo)，驗(yàn)證脫脂乳水解物對嗜熱鏈球菌2017-a 的促生長作用，試驗(yàn)結(jié)果如下。

不同水解度脫脂乳對2017-a 促生長作用情況見圖5，不同培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌2017-a 促生長作用情況見圖6。

上述結(jié)果表明，脫脂乳經(jīng)中性蛋白酶酶解后其酶解物對嗜熱鏈球菌2017-a 的生長有促進(jìn)作用，水解度不同促生長作用情況不同，在最優(yōu)酶解條件下獲得的酶解物促生長作用效果最佳，嗜熱鏈球菌2017-a的菌落總數(shù)可達(dá)2.30×109CFU/mL，較市售M17 培養(yǎng)基其活菌數(shù)提高一個(gè)數(shù)量級（1.7×108CFU/mL）；結(jié)果表明，脫脂乳中性蛋白酶酶解物對嗜熱鏈球菌2017-a 有明顯的促生長作用。脫脂乳中含有豐富的乳清蛋白和酪蛋白，乳清蛋白酶解物可以增加溶解性，對成泡、凝集、乳化能力的改變有促進(jìn)作用，獲得的酶解乳清蛋白多肽具有抗高血壓、降低嬰兒配方奶粉過敏性等功能和生物特性[11]；其酪蛋白酶解物則具有促進(jìn)凝結(jié)、抗過敏、抗血栓形成、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)胃腸吸收、抑制病原菌等多種功能，乳酸菌分解蛋白能力較弱，將富含氨基酸、寡肽的乳蛋白酶解物應(yīng)用于菌體培養(yǎng)是能夠?qū)崿F(xiàn)乳酸菌快速增殖和發(fā)酵[12-14]。

2.7 脫脂乳酶解物發(fā)酵劑穩(wěn)定性

為驗(yàn)證脫脂乳水解物穩(wěn)定性，將制備的酶解物經(jīng)滅菌（酶） 處理后，分別置于室溫和冷藏條件下，測定其pH 值、無菌檢測等相關(guān)性能；并將菌株轉(zhuǎn)接至水解物中，制得發(fā)酵劑，并測定發(fā)酵劑相關(guān)性能，試驗(yàn)結(jié)果如下。

酶解脫脂乳培養(yǎng)基在不同貯藏條件下pH 值變化見圖7，酶解脫脂乳發(fā)酵劑pH 值變化情況見圖8，酶解脫脂乳發(fā)酵劑在4 ℃冷藏條件下活菌數(shù)變化情況見圖9。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的脫脂乳酶解物在室溫和冷藏條件下較為穩(wěn)定，在保藏期間其組織狀態(tài)未發(fā)生改變，無菌檢測結(jié)果顯示，在保藏期間無菌落生長；用酶解物制備發(fā)酵劑，其穩(wěn)定性良好，在冷藏前期菌體繼續(xù)生長，其活菌數(shù)最高可達(dá)2.84×109CFU/mL；酶解脫脂乳發(fā)酵劑性能測定結(jié)果顯示可以將其作為理想的備用生產(chǎn)發(fā)酵劑。

3 結(jié)論

中性蛋白酶酶解脫脂乳的最佳工藝條件為加酶量180 U/mL，酶解溫度55 ℃，起始pH 值6.5，酶解時(shí)間2 h，在此條件下脫脂乳乳蛋白水解度可達(dá)22.1%。在最優(yōu)酶解條件下獲得的脫脂乳酶解物促生長效果最好，嗜熱鏈球菌2017-a 的菌落總數(shù)可達(dá)2.30×109CFU/mL，較商業(yè)M17 培養(yǎng)基其活菌數(shù)提高一個(gè)數(shù)量級，制得的脫脂乳酶解物穩(wěn)定性良好，為生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備提供了理論基礎(chǔ)。