吡柔比星調(diào)控原鈣黏蛋白10的表達對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖、凋亡誘導的作用機制研究

朱平，梁欣泉，廖欣，熊慕珺，符麗梅

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前主要治療方法為化療和干細胞移植，雖然新藥的出現(xiàn)使其療效和生存得到了較大的改善，但仍不可治愈，多以減少疾病復(fù)發(fā)、延緩疾病進展、延長生存期作為治療目標[1]。吡柔比星(pirarubicin，THP)是一種抗癌的化療藥物，有研究證明吡柔比星可有效誘導膀胱癌細胞凋亡，且增加藥物的濃度抑制效果更好，還能有效預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)[2]；吡柔比星治療晚期乳腺癌效果更優(yōu)，能明顯延長生存期，且未出現(xiàn)嚴重的不良反應(yīng)[3]；吡柔比星對治療多發(fā)性骨髓瘤也有較好的的療效，其對多發(fā)性骨髓瘤患者的心臟毒性、脫發(fā)和肝腎功能損傷等不良反應(yīng)明顯減少[4]。但吡柔比星對多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖、凋亡的作用機制尚未清楚。原鈣黏蛋白10(protocadherin 10，PCDH10)是一種抑癌基因，PCDH10基因可能通過下調(diào)PI3K/AKT通路活性而抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI-8226的增殖、遷移和侵襲[5]。本研究旨在研究吡柔比星是否通過PCDH10影響多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖、凋亡，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換液1次，待細胞融和至70 %左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 分組與藥物處理：取對數(shù)生長期細胞，將其接種至96孔板中，并用不同濃度的吡柔比星(0.1 mg/L、1 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L)處理KM3細胞，記為THP 0.1mg/L組、THP 1 mg/L組、THP 2.5mg/L組、THP 5mg/L組；未經(jīng)任何處理的KM3細胞作空白對照(Con)組。

取常規(guī)培養(yǎng)的多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3用0.25 %胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為pcDNA3.1組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-PCDH10組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PCDH10)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-PCDH10組(轉(zhuǎn)染si-PCDH10)；si-NC組和si-PCDH10組轉(zhuǎn)染后再用1 mg/L吡柔比星處理48 h，記作THP 1 mg/L+si-NC組、THP 1 mg/L+si-PCDH10組。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：在以上各組細胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時加入20 μl(5 g/L)MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復(fù)3次。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western-blot法檢測PCDH10蛋白表達:收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果(圖1A)顯示，與Con組相比，不同濃度THP組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的活性顯著降低，呈濃度依賴性(P<0.05); Western-blot法檢測結(jié)果(圖1B)顯示，與Con組相比，不同濃度THP組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Cyclin D1蛋白的表達水平顯著降低，p21蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。選擇對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3抑制率約為50%的THP濃度(1 mg/L)做后續(xù)實驗。

2.2 THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果(圖2A)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的凋亡率顯著升高(P<0.05)。Western-blot法檢測結(jié)果(圖2B)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Bax蛋白的表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。

2.3 THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中PCDH10蛋白表達的影響 Western-blot法檢測結(jié)果(圖3A、B)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中PCDH10蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.4 過表達PCDH10對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖、凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果(圖4A)顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的凋亡率顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測結(jié)果(圖4B)顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的活性顯

著降低(P<0.05)。Western-blot法檢測結(jié)果(圖4C)顯示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，PCDH10、p21、Bax蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.5 抑制PCDH10表達對THP抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響 MTT檢測結(jié)果(圖5A)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的活性顯著降低；與THP 1 mg/L+si-NC組相比，THP 1 mg/L+si-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的活性顯著升高(P<0.05)。Western-blot法檢測結(jié)果(圖5B)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Cyclin D1蛋白的表達水平顯著降低，PCDH10、p21蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)；與THP 1 mg/L+si-NC組相比，THP 1mg/L+si-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Cyclin D1蛋白的表達水平顯著升高，PCDH10、p21蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。

2.6 抑制PCDH10表達對THP促進多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果(圖6A)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的凋亡率顯著升高；與THP 1 mg/L+si-NC組相比，THP 1 mg/L+si-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3的凋亡率顯著降低(P<0.05)。Western-blot法檢測結(jié)果(圖6B)顯示，與Con組相比，THP 1 mg/L組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平顯著升高；與THP 1 mg/L+si-NC組相比，THP 1 mg/L+si-PCDH10組多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高，Bax蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。

注：A.不同濃度THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響；B.不同濃度THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖蛋白表達的影響。與Con組比較，aP<0.05；與THP 0.1 mg/L組比較，bP<0.05；與THP 1 mg/L組比較，cP<0.05；與THP 2.5 mg/L組比較，dP<0.05

圖1不同濃度THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響

注：A.THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響;B.THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡蛋白表達的影響；與Con組比較，aP<0.05

圖2THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響

注：A.THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中PCDH10蛋白表達的影響; B.PCDH10蛋白的相對表達；與Con組比較，aP<0.05

圖3THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3中PCDH10表達的影響

3 討 論

多發(fā)性骨髓瘤會引起組織、器官損傷，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，近幾年隨著新的治療藥物的出現(xiàn)，生存率明顯提高[6]。吡柔比星是蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，灌注治療后能有效抑制膀胱癌復(fù)發(fā)[7]；吡柔比星動脈灌注化療可顯著提高非轉(zhuǎn)移性四肢骨肉瘤的近期臨床療效，提高患者生存率，并提高T淋巴細胞亞群水平[8]。吡柔比星還能誘導人膀胱癌T24細胞凋亡[9]；通過下調(diào)XIAP可抑制鼻咽癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡[10]。而含吡柔比星的方案治療多發(fā)性骨髓瘤患者，可以顯著減少并發(fā)癥，保證治療效果[11]。硼替佐米和地塞米松(BD)方案聯(lián)合環(huán)磷酰胺、吡柔比星化療組能明顯提高復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的緩解率，并可延緩病情進展及延長生存時間，患者耐受性好[12]。本實驗研究結(jié)果也表明，不同濃度的吡柔比星可抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡；抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白的表達，促進PCDH10、p21、Bax蛋白的表達。

注：A.過表達PCDH10對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響;B.過表達PCDH10對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響;C.過表達PCDH10對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖、凋亡蛋白表達的影響；與pcDNA3.1組比較，aP<0.05

圖4過表達PCDH10對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖、凋亡的影響

注：A.抑制PCDH10表達對THP抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響;B.抑制PCDH10表達對THP抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖蛋白表達的影響；與Con組比較，aP<0.05；與THP 1 mg/L+si-NC組比較，bP<0.05

圖5抑制PCDH10表達對THP抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖的影響

注：A.抑制PCDH10表達對THP促進多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響;B.抑制PCDH10表達對THP促進多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡蛋白表達的影響；與Con組比較，aP<0.05；與THP 1 mg/L+si-NC組比較，bP<0.05

圖6抑制PCDH10表達對THP促進多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3凋亡的影響

PCDH10是鈣黏蛋白超家族中的跨膜蛋白，惡性腫瘤中原鈣黏蛋白的表達下調(diào)或者缺失與癌癥進展有關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，PCDH10在結(jié)直腸癌組織中異常甲基化，癌旁組織中表達高于癌組織，PCDH10的甲基化和表達沉默參與結(jié)直腸癌的進展[14]。PCDH10在胃癌組織和舌鱗狀細胞癌中也表達下調(diào)，與腫瘤發(fā)生進展及患者預(yù)后相關(guān)[15-16]。PCDH10上調(diào)通過抑制肝癌細胞中PI3K/Akt信號通路從而抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡[17]。過表達PCDH10能夠明顯抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并且誘導胰腺癌BXPC-3細胞凋亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)，PCDH10基因通過PI3K/Akt通路可抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖、遷移、侵襲及血管新生能力；PCDH10不僅可增強多發(fā)性骨髓瘤細胞對表阿霉素的敏感性，還可減少多發(fā)性骨髓瘤細胞逃避表阿霉素的殺傷，從而增強表阿霉素的抗骨髓瘤效應(yīng)[19-20]。本實驗研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，過表達PCDH10可抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡；且抑制PCDH10表達能逆轉(zhuǎn)THP對多發(fā)性骨髓瘤細胞KM3增殖抑制和凋亡促進作用。

綜上所述，吡柔比星可抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與上調(diào)PCDH10有關(guān)，本研究將為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新思路和新靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

朱平：設(shè)計研究方案，實施研究過程，統(tǒng)計學分析，撰寫、修改論文；梁欣泉：提出研究思路，論文審核；廖欣：分析實驗數(shù)據(jù)；熊慕珺：資料收集；符麗梅：實施實驗，論文修改