聯(lián)合應用IL-4突變體及抗IL-25抗體對哮喘小鼠炎性細胞及細胞因子水平的影響

成家軍 張方琪 張芳 楊學敏

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，由免疫細胞及結構細胞(包括T細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、和上皮細胞)共同導致氣道炎癥、粘液分泌及氣道重塑[1]。全球約3億哮喘患者，每年約有250000患者死于哮喘，且需要有十億美金的醫(yī)療支出[2]。近年來，隨著環(huán)境污染，食品污染等，過敏患者越來越多，繼而使哮喘發(fā)病率不斷升高，部分患者控制差，臨床急需針對哮喘氣道炎癥治療的新方法[3]。哮喘是多種細胞參與的慢性氣道炎癥，嗜酸性粒細胞是哮喘氣道炎癥的關鍵效應細胞，

細胞因子IL-4、IL-5、IL-13及腫瘤壞死因子α(TNFα)，在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮主要作用[4]。IL-4是B淋巴細胞合成IgE過程中的關鍵因子，IgE直接參與哮喘發(fā)生，在氣道炎癥及氣道高反應中，IL-4比IL-13發(fā)揮的作用更加重要[5]。

研究表明，nuocytes等2型固有免疫細胞可不依賴于T細胞、B細胞直接誘導小鼠產生哮喘表型，其中IL-25、IL-33等細胞因子在2型固有免疫細胞功能調控中起到關鍵作用，且很可能成為新的變應性哮喘的防治靶點[6]。為此，我們擬在前期的研究基礎上，進一步觀察IL-4突變體聯(lián)合抗IL-25抗體對哮喘小鼠的影響，探討哮喘發(fā)病中適應性免疫應答和固有免疫應答之間交互控制作用，豐富變應性哮喘的治療內容，為其防治提供新的思路。

資料與方法

一、材料

① 動物：雌性BALB/c小鼠(6～8周齡)，來源于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，非含雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度(23±2)℃ ，濕度約為(55.5±10)℃。② 主要藥物和試劑：OVA(美國Sigma公司)、生理鹽水、AL(OH)3、IL-4突變體(本課題組實驗合成)、抗IL-25抗體(上海西唐生物科技有限公司)、ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

二、實驗動物分組

實驗小鼠按隨機方法分為5組，每組10只，即對照組、哮喘組、IL-4突變體治療組、抗IL-25抗體治療組、聯(lián)合IL4突變體及抗IL-25抗體治療組(簡稱聯(lián)合治療組)。

三、哮喘模型制備及干預

各組小鼠(對照組除外)分別于第0天、7天和14天腹腔注射20 ug OVA和20 mg AL(OH)3凝膠與0.9%氯化鈉混合液200 μL致敏，對照組腹腔注射相同體積0.9%氯化鈉溶液。第21天至第27天將小鼠(對照組除外)置于密閉容器中，超聲霧化吸入5% OVA生理鹽水誘發(fā)哮喘，每天1次，每次30min，其中IL-4突變體治療組、抗IL-25抗體治療組及聯(lián)合治療組分別于誘發(fā)前30min 給予腹腔注射100 μg IL-4突變體、抗IL-25抗體及聯(lián)合應用IL-4突變體及抗IL-25抗體各100 μg，對照組和哮喘組激發(fā)前30 min給予腹腔注射相同體積生理鹽水，共7d，對照組用生理鹽水代替OVA進行激發(fā)。

四、采血及細胞學計數(shù)

末次激發(fā)24 h后，經(jīng)小鼠眼球采血，所采血液分為兩部分，一部分直接用動物血細胞分析儀檢測血液中炎性細胞計數(shù)，另一部分血液靜置1 h后，經(jīng)離心機分離3 000 r/min 離心15min留取血清，將血清放于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

五、細胞因子的測定

采用ELlSA法，檢測血清中IL-4、IL-25、IgE水平，操作過程嚴格按照說明書進行。

六、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均以計量資料的描述采用均數(shù)、標準差。各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行比較，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法;采用P<0.05為差異有臨床意義。

結 果

一、各組小鼠外周血中白細胞及嗜酸性粒細胞計數(shù)

與對照組相比，哮喘組血液白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與哮喘組比較，IL-4突變體治療組、抗IL-25抗體治療組及聯(lián)合治療組白細胞及嗜酸性粒細胞數(shù)均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組與單純治療組比較，白細胞及嗜酸性粒細胞數(shù)均進一步下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示聯(lián)合治療效果更佳(見表1)。

表1 各組小鼠外周血中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞數(shù)比較

注：與正常組比較，aP<0.001；與哮喘組比較，bP<0.001；與聯(lián)合治療組比較,cP<0.001。

二、各組小鼠血清中細胞因子水平

與正常組比較，哮喘組血清中細胞因子IL-4、IL-25、IgE水平明顯增高(P<0.01)。與哮喘組相比，IL-4突變體治療組血清中IL-4水平增高(P<0.05)，IgE、IL-25水平下降(P<0.05)；抗IL-25抗體治療組IL-4、IL-25、IgE水平均有所降低(P<0.05)；聯(lián)合治療組中IL-4、IL-25、IgE水平下降(P<0.05)；聯(lián)合治療組與單純治療組比較，IL-25、IgE(P<0.05)水平下降更為顯著，提示聯(lián)合組對哮喘小鼠相關細胞因子水平緩解更佳(見表2)。

表2 各組小鼠血清中IL-4、IL-25、IgE水平比較

注：與正常組比較，aP<0.001；與哮喘組比較，bP<0.001；與聯(lián)合治療組比較，cP<0.001。

討 論

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)在可逆性的氣道受限，氣道炎癥和氣道高反應性，嗜酸性粒細胞及2型細胞因子分泌細胞，包括Th2細胞和2型固有免疫細胞，是過敏性哮喘患者氣道慢性炎癥的主要組成部分[7]。IL-25是IL-17家族成員，IL-17E，和其他成員不同的是，IL-25主要由Th2細胞產生，且維護2型固有免疫應答[8]，IL-25可直接激活嗜酸性粒細胞，通過提高粘附分子ICAM-1，刺激前炎癥因子如單核細胞趨化蛋白1、IL-8，巨噬細胞炎癥性蛋白1和IL-6[9]。研究顯示，與非哮喘患者及非過敏性的正常受試者比較，無癥狀的輕度哮喘患者中嗜酸性粒細胞中的IL-17RA和IL-17RB，及血漿中的IL-25表達均明顯增高[10]。IL-25刺激的小鼠，Th2型細胞因子IL-4，IL-5及IL-13等細胞因子明顯增多，繼而IgE、嗜酸性粒細胞增多，上皮細胞增生肥大、粘液分泌增多[11]。研究表明IL-25在哮喘氣道募集未成熟嗜酸性粒細胞中發(fā)揮重要作用，且IL-25的促炎效果很強，IL-25可能是減輕過敏原誘導的氣道反應的有用藥物靶標[12]，相反IL-25抗體可減少過敏性哮喘動物模型中氣道炎癥[13]，IL-25缺失小鼠中肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的數(shù)量及促炎癥介質的水平明顯降低[14]。這與本研究的結果一致，哮喘小鼠中炎性細胞及炎性因子均明顯增多，但抗IL-25抗體組的相關炎癥細胞及炎癥因子均較哮喘組降低，聯(lián)合治療組亦降低，均具有統(tǒng)計學意義。

Th2淋巴細胞通過釋放細胞因子，尤其是白細胞介素IL-4，IL-5和IL-13，在過敏性哮喘的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[15-16]。IL-4導致B細胞形成IgE，IgE介導的肥大細胞活化，在過敏性哮喘的病因中起關鍵作用[17]。IL-4與其受體的結合導致信號轉導和轉錄激活因子6(STAT-6)的磷酸化，并最終誘導Th2相關轉錄因子GATA3的表達[18]。GATA3被證實為Th2相關的主轉錄因子，其誘導Th2細胞中產生IL-4，IL-5和IL-13[19]。研究結果表明[20]，與健康人相比，哮喘患者血清IL-4和GATA3表達水平顯著升高，結果證實了哮喘患者的Th2細胞偏向模式與其他研究中獲得的數(shù)據(jù)一致，這些研究顯示過敏性哮喘中過量的Th2免疫反應[21]。哮喘患者血清IL-4水平升高和GATA3表達升高證實哮喘患者的Th2細胞偏離，這在過敏性哮喘的發(fā)病機制中起著重要作用。IL-4突變體可結合IL-13受體，阻斷IL-4受體α及IL-13受體α1，從而阻斷IL-4及IL-13的作用[22]。本研究結果顯示單藥治療組IgE、IL-25及炎性細胞水平均降低，聯(lián)合應用效果更明顯。而單用IL-4突變體組IL-4水平有所升高，這與之前研究結果基本一致[23]。我們考慮IL-4突變體靶向競爭IL-4受體，使得IL-4無法與受體結合而降解，導致血清中IL-4水平短暫性的增高[24]，推測IL-4將隨時間延長而逐漸降低。

綜上，本研究利用IL-4突變體及抗IL-25抗體聯(lián)合干預哮喘小鼠，阻斷炎性細胞及炎癥因子的聚集，相對于單突變體及單抗體治療，顯著降低了肺部炎性細胞及炎癥因子，從而抑制了哮喘小鼠氣道炎癥的發(fā)展，為哮喘的治療提供一條新的治療思路。