長鏈非編碼RNA Linc8910對膠質(zhì)瘤干細胞增殖和自我更新的影響

蔡巖，肖大可，潘欣，滿江紅

國家生物醫(yī)學分析中心，北京 100850

膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是人腦最常見、最致命的原發(fā)性腫瘤。腦膠質(zhì)瘤患者平均生存周期僅為12～15個月[1-2]。膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cell，GSC）是位于腦膠質(zhì)瘤細胞頂層的具有自我更新、多向分化及增殖潛能的一類腫瘤細胞[3-5]，它們能夠起始腫瘤發(fā)生并且對放化療不敏感。越來越多的證據(jù)表明腦膠質(zhì)瘤干細胞是腦膠質(zhì)瘤生長、轉(zhuǎn)移與復發(fā)的決定性因素[6-7]。

人類基因組中大部分RNA不能被翻譯為蛋白質(zhì)，這類RNA被稱為非編碼RNA[8]。一部分非編碼RNA的長度大于200個核苷酸，被稱為長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）。其中，基因間長鏈非編碼RNA（long intergenic non-coding RNA，LincRNA）是一類處于編碼基因之間的非編碼RNA，通常小于蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄本。LincRNA的表達量低，但卻表現(xiàn)出較強的組織特異性[9-11]。部分研究表明LincRNA在表觀遺傳、細胞周期及分化等生命活動中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在腦膠質(zhì)瘤中，LincRNA的異常表達影響著腫瘤細胞的生長與分化，對腦腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用[12-15]。然而，LincRNA在膠質(zhì)瘤干細胞中的功能有待進一步研究。

本實驗室前期通過RNA測序篩選，比對了多株不同腦膠質(zhì)瘤患者來源的GSC以及對應的非干性腫瘤細胞中LncRNA的表達，篩選出一系列在GSC中特異性高表達且發(fā)揮重要功能的LncRNA。通過TCGA數(shù)據(jù)庫對篩選到的LncRNA進行臨床相關性分析，我們發(fā)現(xiàn)Linc8910具有良好的預后相關性。本研究通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）干涉技術在GSC中敲低Linc8910，檢測其對GSC的增殖能力及自我更新能力的影響。進一步探究了Linc8910在膠質(zhì)瘤干細胞生長增殖中的功能，從LncRNA角度為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞

人胚胎腎細胞HEK293T來自中國科學院上海細胞庫；人源GSC細胞T4121受贈于美國加州大學Jeremy Rich實驗室，該細胞株按照本實驗室方案進行了篩選及鑒定。

DMEM培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA、谷氨酰胺（100×）、青霉素-鏈霉素混合液（100×）、丙酮酸鈉（100 mmol/L）、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑MaxiCaP購自中科邁晨（北京）科技有限公司；胎牛血清購自Ex-Cell Bio生物科技有限公司；PowerUp SYBR Green Master Mix、Neuro-basal培養(yǎng)基、B-27血清替代物購自Thermo Fisher公司；Accutase購自Sigma公司；堿性成纖維細胞生長因子（β-FGF）、重組人表皮生長因子（rhEGF）購自R&D Systems公司；PrimeScript RT Master Mix購自TaKaRa公司；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay購自Promega公司；RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司。

Q-PCR儀（LC96）購自 Roche公司；PCR儀（GSX1）、CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（FORMA3111）、熒光成像顯微鏡（EVOSM5000）購自Thermo Fisher Scientific公司；Glomax全自動熒光檢測儀（9101-002）購自Promega公司；微量分光儀（NanoDrop 2000c）購自基因有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

在無菌超凈臺中配制培養(yǎng)基。

1.2.1 DMEM完全培養(yǎng)基 向500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入50 mL胎牛血清和5.5 mL青霉素-鏈霉素混合液，充分混勻后放置4℃冰箱保存。

1.2.2 干細胞完全培養(yǎng)基 向500 mL Neurobasal培養(yǎng)基中加入青霉素-鏈霉素混合液、丙酮酸鈉和左旋谷氨酰胺各5 mL，加入10 mL B-27血清替代物以及濃度均為20 ng/mL的rhEGF和β-FGF各20 μL，充分混勻后4℃保存。

1.3 細胞培養(yǎng)及傳代

1.3.1 HEK293T的培養(yǎng)與傳代 用DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。細胞密度過高會影響細胞生長，因此當細胞密度大于85%時須進行傳代培養(yǎng)。具體步驟為：棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基；沿培養(yǎng)皿內(nèi)壁加入無菌PBS，輕輕搖晃培養(yǎng)皿洗凈細胞代謝物和殘余培養(yǎng)基，棄去PBS；向培養(yǎng)皿中加入1 mL Trypsin-EDTA，于37℃培養(yǎng)箱靜置1 min進行消化；向培養(yǎng)皿中加入3 mL DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r/min離心3 min，棄上清；用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞后接種在新的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 GSC的培養(yǎng)與傳代 用干細胞完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。GSC在培養(yǎng)過程中會聚集形成腫瘤細胞球，腫瘤細胞球較大時會影響細胞增殖和生長狀態(tài)，因此須消化傳代。具體步驟為：將培養(yǎng)皿中的全部細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r/min離心3 min，棄上清；用無菌PBS重懸細胞并反復吹洗，800 r/min離心3 min，棄上清；用1 mL Accutase胰酶重懸細胞，消化3 min；加入5 mL無菌PBS稀釋胰酶和細胞的混懸液，800 r/min離心3 min，棄上清；用干細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 血清誘導GSC分化

將GSC消化成單個細胞后，離心去上清，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，充分混勻后接種于培養(yǎng)皿中。由于DMEM完全培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清，可以誘導GSC向非干性腫瘤細胞（non-stem tumor cell，NSTC）分化。GSC完全分化為NSTC的評價標準為SOX2和Olig2蛋白（GSC相關蛋白標志物）逐漸減少至消失，同時膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，NSTC蛋白標志物）表達明顯增加，在細胞形態(tài)上可以看到細胞處于貼壁狀態(tài)，無法形成腫瘤球。按照此方法分化GSC，約7 d分化為NSTC。

1.5 慢病毒包裝及感染細胞

將3×106HEK293T細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細胞密度長至30%～40%時采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒進行病毒包裝。向1.5 mL EP管中加入包裝質(zhì)粒psPAX2和pCMV-VSVG各5 μg，目的質(zhì)粒（pLKO-shNT、pLKO-sh8910#1、pLKO-sh8910#2和pLKO-sh8910#3）各 5 μg，用 1 mL HBS 混勻，靜置5 min；滴入 70 μL CaCl2溶液，混勻后靜置 15 min；將轉(zhuǎn)染體系滴加到提前接種的HEK293T細胞中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使液體混勻，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，72 h后將培養(yǎng)基上清收集至50 mL離心管中，3500 r/min離心15 min，用0.45 μm孔徑的濾器過濾到新的離心管中，向過濾后的病毒液體中加入病毒濃縮液（5×PEG），顛倒混勻，4℃靜置過夜；將病毒液體于4℃、7000 r/min離心15 min，吸去上清，用1 mL冰PBS重懸病毒沉淀，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心15 min，取上清分裝到600 μL無菌EP管中，每管分裝200 μL，-80℃保存。

將GSC消化處理成單個細胞，取1.5×106GSC用干細胞培養(yǎng)基重懸，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入200 μL病毒后充分混勻，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d傳代一次。

1.6 在mRNA水平檢測Linc8910的表達

收取1×106分化前的GSC及分化后的NSTC，用RNeasy Mini Kit提取RNA。加入350 μL Buffer RLT重懸細胞并充分裂解；加入350 mL無RNA酶的70%乙醇混勻，立即轉(zhuǎn)入結合柱；室溫靜置2 min，10 000 r/min離心30 s，棄下層液體；向結合柱中加入 700 μL RW Wash Buffer，4℃、10 000 r/min離心30 s，棄下層液體；加入500 μL RPE Buffer，4℃、10 000 r/min離心30 s，棄下層液體，重復此步驟2次；將結合柱放入新的無RNA酶的EP管中，每管加入40 μL無RNA酶水，靜置2 min；室溫10 000 r/min離心2 min洗脫，用NanoDrop 2000c測量濃度。

將提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。向PCR管中加入 2 μL 提取的 RNA 樣品和 2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，最后加入6 μL無RNA酶水補齊總體系至10 μL，在PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄，程序為37℃ 15 min、85℃ 15 s。在Q-PCR引物設計相關網(wǎng)站（Primer Bank）查找適合Linc8910的QPCR引物，由北京博邁德基因科技有限公司合成。10 μL Q-PCR反應體系包括逆轉(zhuǎn)錄的Linc8910的cDNA模板3 μL、上游和下游引物各0.25 μL、SYBR Green Master Mix 5 μL、ddH2O 1.5 μL。將體系加到96孔板中，于Q-PCR儀中按設定程序進行擴增。

1.7 細胞活力測定及腫瘤細胞球形成能力

將感染病毒后的GSC消化處理成單個細胞，臺盼藍染色計算活細胞數(shù)目。將敲低組和對照組分別接種到96孔板，每孔2×103細胞，每組3個復孔，采用CellTiter-Glo試劑盒分別檢測第0、2、4 d的細胞活力。每孔加入100 μL CellTiter-Glo試劑，混勻后取200 μL加到可避光的黑色96孔板中，水平搖床孵育10 min，用Glomax全自動熒光儀檢測細胞活力。觀察第6 d孔板里的腫瘤球數(shù)目和形態(tài)，用成像顯微鏡拍攝。

1.8 數(shù)據(jù)來源與分析

Linc8910信息源自UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫（http://genome.ucsc.edu/）。所有數(shù)據(jù)分析均使用GraphPad Prism 8.02軟件。將T4121 GSC分化前后以及敲低Linc8910后檢測得到的mRNA水平數(shù)據(jù)按分組整理，填入GraphPad Prism 8.02軟件的表格中繪制生成圖表，圖3A組間差異分析采用t檢驗。

2 結果

2.1 Linc8910基本信息

UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫調(diào)研分析表明，Linc8910的名稱為PCOLCE-AS1，位于第7號染色體上，全長2550 bp（圖1）。

圖1 Linc8910基本信息（UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫）

2.2 Linc8910在GSC中特異性高表達

選取T4121 GSC及其分化第6 d的NSTC，分別收取細胞樣品，裂解后提取RNA。用2對不同的引物（Primer1和Primer2）對Linc8910的表達進行Q-PCR驗證，用干細胞標志蛋白Olig2和Sox2的表達水平指示GSC分化情況。結果顯示，GSC在血清誘導分化第6 d時其干細胞標志物的表達明顯降低，表明GSC分化。Linc8910在T4121 GSC中的mRNA水平明顯高于其分化后的NSTC（圖2）。以上結果表明Linc8910在T4121 GSC中高表達，而在T4121 NSTC中低表達。

圖2 Linc8910在T4121 GSC和分化后的NSTC中的mRNA表達水平（x±s，n=3）

2.3 敲低Linc8910對GSC生長的影響

為了敲低Linc8910在細胞內(nèi)的表達，我們構建了靶向Linc8910不同序列的shRNA干涉質(zhì)粒sh8910#1、sh8910#2、sh8910#3及對照干涉質(zhì)粒shNT，并進行慢病毒包裝。慢病毒感染T4121 GSC后72 h收取細胞樣品，提取RNA后進行QPCR分析，對Linc8910的敲低效果進行檢測（圖3A）。同時，我們將感染病毒后的GSC消化成單個細胞，將敲低組和對照組細胞分別接種96孔板，用Cell Titer-Glo試劑盒測定第0、2、4 d的細胞活力（圖3B）。此外，我們將病毒感染后的GSC接種于96孔板，觀察細胞形成腫瘤球的情況，并用成像顯微鏡拍攝GSC形成腫瘤球的形態(tài)（圖3C）。實驗結果表明，靶向Linc8910的3條不同的shRNA干涉序列均具有良好的敲低效果。細胞活力測定結果顯示Linc8910敲低組的細胞活力明顯低于對照組，表明敲低Linc8910能夠明顯抑制GSC的增殖能力。腫瘤球形成實驗結果顯示，Linc8910敲低組的腫瘤細胞球數(shù)量明顯少于對照組，表明敲低Linc8910能夠顯著抑制GSC的自我更新能力。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤，它的發(fā)生發(fā)展與多種因素密切相關。膠質(zhì)母細胞瘤是腦腫瘤中惡性程度最高的原發(fā)性實體瘤。GBM具有較強的浸潤性，與正常腦組織無明顯邊界，導致難以完全切除[16-17]。目前，臨床上主要的治療手段為手術切除聯(lián)合藥物治療及放射治療等，但治療效果不理想。研究表明，GSC在GBM的發(fā)生、維持、轉(zhuǎn)移與復發(fā)過程中均發(fā)揮著關鍵性作用[18-19]。因此，將GSC作為研究對象并探究其調(diào)控機制，對GBM的發(fā)生和治療具有重要意義。

目前，對于LncRNA在GSC中的功能研究較少。部分研究表明，腦膠質(zhì)瘤中LncRNA的異常表達可能影響GSC的生長與分化，對腦腫瘤發(fā)生有重要影響[13,20]?；诒緦嶒炇业腉SC研究體系，我們從LncRNA角度探究其對GSC的調(diào)控機制。我們通過RNA測序篩選技術鑒定到Linc8910在GSC中特異性高表達，且表達水平顯著高于其對應的NSTC。為了了解Linc8910在GSC中的功能，通過shRNA干涉技術在GSC中敲低Linc8910，發(fā)現(xiàn)敲低Linc8910表達能夠顯著抑制GSC的腫瘤細胞球形成能力及細胞活力，提示Linc8910對GSC的增殖及腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展可能具有重要的調(diào)控功能。我們將進一步探究Linc8910在GSC中的作用機制，為腫瘤治療提供新的靶點和策略。