改良的幽門螺桿菌噬菌體裂解酶在大腸桿菌和畢赤酵母中表達的活性差異

徐登圓，趙珊珊，竇俊，方宏清，徐曉峰，支艷艷，李曉穩(wěn)，文良柱

1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198；2.江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 徐州 221004

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）是革蘭陰性菌，感染率極高，95%的胃病由它引起，甚至導(dǎo)致胃癌[1-2]。目前，臨床多采用抗生素治療幽門螺桿菌感染，最常用的治療方法是標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法和四聯(lián)療法，例如鉍劑+甲硝唑+四環(huán)素+奧美拉唑、奧美拉唑+阿莫西林+克拉霉素、鉍劑+替硝唑+克拉霉素等[3]。這些治療方法患者依從性差，且由于抗生素的濫用，幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性問題越來越嚴(yán)重。經(jīng)過多年研究和開發(fā)，很難篩選出新的抗生素，抗生素已無法滿足臨床對于抗幽門螺桿菌感染的治療需求。因此，當(dāng)務(wù)之急是尋找一種新型抗菌制劑來應(yīng)對耐藥菌的威脅，迫切需要新型藥物替代傳統(tǒng)療法，以達到根治幽門螺桿菌的目的。

噬菌體是一種細(xì)菌病毒，廣泛存在，特異性高，易于分離獲得。但噬菌體是一個獨立的生命體，當(dāng)它直接用作抗菌制劑時，生物安全性一直飽受質(zhì)疑[4]。噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)由裂解酶和穴蛋白組成，是雙鏈DNA噬菌體在侵染細(xì)菌后期所表達的水解酶[5]。研究認(rèn)為噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：特異性強，在殺滅病原菌的同時不會干擾正常菌群；不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，由于裂解酶是噬菌體在與細(xì)菌共同進化過程中產(chǎn)生的，針對細(xì)菌細(xì)胞壁上高度保守的肽聚糖，所以產(chǎn)生耐藥性的幾率很??；沒有噬菌體的增殖能力；具有高效的殺菌機制，能在短時間內(nèi)裂解細(xì)菌[6]。

噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)的作用機制分為體內(nèi)裂解和體外裂解。體內(nèi)裂解時先由穴蛋白在宿主細(xì)胞膜打孔，之后裂解酶作用于細(xì)胞壁進而裂解細(xì)菌。體外裂解時由裂解酶直接作用于細(xì)胞壁，進而裂解細(xì)菌。由于革蘭陽性菌與陰性菌之間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，其各自的裂解酶也存在明顯差異。目前，革蘭陽性菌噬菌體裂解酶發(fā)展較為成熟，可利用結(jié)構(gòu)域設(shè)計，其中包括2個模塊，即細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域（可用于細(xì)菌細(xì)胞壁識別）和酶催化活性結(jié)構(gòu)域（發(fā)揮酶促活性作用，裂解肽聚糖結(jié)構(gòu)中的特異性鍵）[7-9]。針對革蘭陰性菌為宿主的噬菌體裂解酶主要是單域球狀蛋白，分子較小（相對分子質(zhì)量為15 000～20 000），通常沒有特定的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域模塊[10]。相比于陽性菌的噬菌體裂解酶，陰性菌噬菌體裂解酶可能會更好地發(fā)揮酶的催化作用[11]。細(xì)菌裂解后，不會被細(xì)胞壁碎片緊密地結(jié)合，一定程度上可脫落進而裂解下一個宿主菌。而對于革蘭陰性菌，細(xì)胞壁周圍存在細(xì)菌外膜（outer membrane，OM），可以限制裂解酶從外部進入肽聚糖層。目前，對于幽門螺桿菌噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)的研究較少。因此，探究幽門螺桿菌噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)的生物學(xué)特性，并將其與外膜滲透劑聯(lián)用，或?qū)ζ溥M行修飾改造以達到穿透外膜的效果是目前的研究方向[12]。

我們根據(jù)已公開的幽門螺桿菌噬菌體KHP30的全基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件分析可能的雙組分裂解系統(tǒng)基因序列，并在其N端連上一段具有穿透外膜作用的疏水性多肽GFFIPAVILPSIAFLIVP，得到改良型幽門螺桿菌噬菌體裂解酶（下文簡稱改良型裂解酶），經(jīng)密碼子優(yōu)化后，分別在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母X33中表達，并在體外驗證其溶菌活性差異，為其在抗幽門螺桿菌感染中的應(yīng)用與發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）、DH5α，畢赤酵母 X33購自MERCK公司；幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392購自上海北諾生物科技有限公司；質(zhì)粒pSUMO和pGAPZαA購自淼靈生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；幽門螺桿菌固體及液體培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；溶菌酶購自SIGMA公司；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

JFCH280制冷搖床、SW-CJ-1FD超凈工作臺（上海京孚儀器有限公司）；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機、基因?qū)雰x（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速超低溫冷凍離心機（ThermoFisher Scientific公司）；AKTA蛋白純化儀（GE公司）；伯樂電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 構(gòu)建重組表達載體pSUMO-改良型裂解酶和pGAPZαA-改良型裂解酶

在改良型裂解酶N端再連上一段VDDDK腸激酶酶切位點基因，按照大腸桿菌BL21（DE3）系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化，將設(shè)計的改良型裂解酶基因交由金斯瑞公司合成并亞克隆進質(zhì)粒載體，通過XhoⅠ和SacⅠ連接入pSUMO載體，得到重組表達載體pSUMO-改良型裂解酶。

在改良型裂解酶N端連上Kex2、Ste13酶切位點KREAEA，按照畢赤酵母X33系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化，通過XhoⅠ和XbaⅠ連接入pGAPZαA載體，且目的基因中不能有AvrⅡ和BspHⅠ線性化酶切位點。將設(shè)計的基因交由南京金斯瑞公司合成并亞克隆進質(zhì)粒載體，得到重組表達載體pGAPZαA-改良型裂解酶。

1.3 構(gòu)建重組工程菌BL21（DE3）-pSUMO-改良型裂解酶

采用氯化鈣法制備大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，熱擊法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pSUMO-改良型裂解酶，經(jīng)卡那霉素抗性篩選及測序驗證得到重組工程菌BL21（DE3）-pSUMO-改良型裂解酶。

1.4 構(gòu)建重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶

采用氯化鈣法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，熱擊法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGAPZαA-改良型裂解酶，經(jīng)博來霉素抗性篩選得到重組工程菌DH5αpGAPZαA-改良型裂解酶。利用重組工程菌DH5α-pGAPZαA-改良型裂解酶富集重組質(zhì)粒，經(jīng)AvrⅡ酶切回收得到10 μg線性化質(zhì)粒L-pGAPZαA-改良型裂解酶。采用山梨醇法制備畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化L-pGAPZαA-改良型裂解酶，經(jīng)博來霉素抗性篩選及測序驗證得到重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶。

1.5 2種表達系統(tǒng)表達與純化改良型裂解酶

取300 μL工程菌BL21（DE3）-pSUMO-改良型裂解酶甘油菌，接種于30 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床過夜活化后，全部轉(zhuǎn)接于3 L LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至菌液D600nm值約1.0時，加入IPTG，使其終濃度為0.5 mmol/L，20℃誘導(dǎo)12 h進行改良型裂解酶的表達，誘導(dǎo)表達結(jié)束后8500 r/min離心20 min收獲菌體沉淀，用Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）洗滌沉淀2次，將沉淀重懸于30 mL Tris-HCl緩沖液中，并使用冰浴在低于10℃的溫度下超聲波破碎細(xì)胞（400 W，超聲 5 s，間隔 10 s，工作 180次），收集上清液（超聲處理后的可溶性蛋白）和沉淀物（溶解在8 mol/L尿素中），取同等體積樣品進行SDS-PAGE分析[16-17]。

將收集得到的超聲破菌上清液經(jīng)Ni-NAT填料進行親和層析柱純化，用20個柱體積的含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫柱子，按0～100%，40個柱體積進行梯度洗脫，收集洗脫峰，測蛋白濃度并進行SDS-PAGE驗證[18]。

收集得到的洗脫峰采用腸激酶進行酶切激活，將脫鹽后的SUMO-改良型裂解酶融合蛋白經(jīng)腸激酶（1∶200）在室溫下過夜即可得到具有活性的改良型裂解酶，并進行電泳分析。

另外，取100 μL重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶甘油菌接種入10 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)過夜，取過夜活化的菌液100 μL轉(zhuǎn)接入50 mL YPD培養(yǎng)基中，裝液量為20%，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)。分別在0、24、48、72和96 h取樣1 mL離心收集上清液，并進行SDS-PAGE分析。在表達量最高的時間點，以8500 r/min離心20 min收集發(fā)酵液上清，上清采用3K超濾濃縮，用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）置換體系3次，得到改良型裂解酶粗提溶液[19]。

1.6 濾紙片法抑菌試驗

取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，平板劃線接種幽門螺桿菌ATCC700392培養(yǎng)物，于37℃、微需氧環(huán)境（50 mL/L O2，100 mL/L CO2，850 mL/L N2）中培養(yǎng)72 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，混勻[20]。采用快速尿素酶試驗（rapid urease test，RUT）、過氧化氫酶試驗和涂片革蘭染色后顯微鏡下觀察等對菌種進行鑒定[21]。鑒定為陽性的菌液用滅菌生理鹽水溶液溶解，酶標(biāo)儀測定D600nm值為4.8～8.4之間，即得1×109CFU/mL的菌液。取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，將幽門螺桿菌菌液均勻涂布在其表面，用無菌鑷子貼加濾紙片，向濾紙片上滴加30 μL藥液，37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h觀察平板是否有抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

陽性對照為2 mg/mL溶菌酶；陰性對照為50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）；樣品分別采用大腸桿菌表達系統(tǒng)和畢赤酵母表達系統(tǒng)表達的改良型裂解酶，濃度均為2 mg/mL。

1.7 電鏡觀察幽門螺桿菌裂解狀態(tài)

取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，平板劃線接種幽門螺桿菌ATCC700392培養(yǎng)物，于37℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h，用PBS緩沖液洗下菌苔，2000 r/min離心5 min收集菌體，菌體中加入1 mg/mL溶菌酶及改良型裂解酶，以加入緩沖液50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）為陰性對照組。搖床孵育20 min，取樣離心后用2.5%戊二醛固定液和1%鋨酸固定液固定，再經(jīng)脫水干燥后進行電鏡觀察。

1.8 液體法抑菌試驗

取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，平板劃線接種幽門螺桿菌ATCC700392培養(yǎng)物，于37℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h，用滅菌幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基洗下菌苔，混勻。取250 μL菌液加入比色皿，酶標(biāo)儀測其D600nm值。在四分格平板中加入藥液及菌液，使菌液D600nm值為0.55，且溶菌酶濃度為1 mg/mL，樣品濃度為0.5 mg/mL，以加入緩沖液50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）為陰性對照組，總體積為2 mL。將四分格平板放入2.5 L厭氧罐，厭氧罐內(nèi)放入微需氧產(chǎn)氣袋，再將厭氧罐放入搖床，37℃、150 r/min 培養(yǎng)[22]。在 0、6、24、30 h 分別取樣200 μL，酶標(biāo)儀測其D600nm值，繪制柱狀裂菌效果圖。

2 結(jié)果

2.1 改良型裂解酶生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件分析推測的幽門螺桿菌噬菌體穴蛋白和裂解酶相對分子質(zhì)量分別為12 090和16 870。基于二者設(shè)計的改良型裂解酶相對分子質(zhì)量為31 350，等電點為9.1。其中穴蛋白存在3段跨膜區(qū)域，改良型裂解酶不含信號肽序列，且無相似的三級結(jié)構(gòu)模型。

2.2 大腸桿菌表達系統(tǒng)BL21（DE3）表達改良型裂解酶

重組質(zhì)粒pSUMO-改良型裂解酶成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)卡那霉素抗性篩選和測序驗證得到重組工程菌BL21-pSUMO-改良型裂解酶，經(jīng)3 L培養(yǎng)基發(fā)酵后得到12 g菌體。誘導(dǎo)前后全菌電泳在相對分子質(zhì)量約45 000處條帶有一定的加深，但并不明顯，可能由于蛋白可溶性表達量低（圖1）。超聲波破菌后，SUMO-改良型裂解酶融合蛋白多存在于上清中，沉淀中基本無（圖2）。破菌上清液經(jīng)Ni柱純化，在咪唑濃度為25 mmol/L時有較純的洗脫峰，得到較純的融合蛋白（圖3）。SUMO-改良型裂解酶融合蛋白經(jīng)超濾脫鹽后，由腸激酶酶切得到粗純的改良型裂解酶，濃度為2 mg/mL，純度約80%（圖4）。由于改良型裂解酶具有一定的酶活性，不再多次反復(fù)進行純化，直接用粗純液進行體外抑菌試驗。

圖1 菌體誘導(dǎo)前后電泳圖

圖2 超聲破菌后電泳圖

圖3 Ni柱純化電泳圖

圖4 腸激酶激活改良型裂解酶電泳圖

2.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)X33表達改良型裂解酶

重組質(zhì)粒pGAPZαA-改良型裂解酶電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，經(jīng)博來霉素抗性篩選和測序驗證，得到重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶。該重組工程菌由組成型GAP啟動子表達目的蛋白，不需要甲醇誘導(dǎo)。在50 mL YPD培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h時，改良型裂解酶表達量最高，此時蛋白濃度為0.04 mg/mL（圖5）。發(fā)酵液上清3k超濾濃縮并置換體系得到濃度為2 mg/mL的改良型裂解酶粗體液，純度達80%以上（圖6）。

圖5 不同時間點發(fā)酵液上清電泳圖

圖6 3k超濾前后電泳圖

2.4 2種表達系統(tǒng)表達的改良型裂解酶體外活性分析

2.4.1 濾紙片法 濾紙片法證明由大腸桿菌和畢赤酵母表達得到的改良型裂解酶均可以裂解幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392。在濃度為2 mg/mL時，大腸桿菌表達的改良型裂解酶可形成直徑約0.75 cm的抑菌圈，而畢赤酵母表達的改良型裂解酶可形成直徑約0.5 cm的抑菌圈（圖7）。初步證實了改良型裂解酶對幽門螺桿菌具有一定的裂菌活性，且對于裂菌活性而言，大腸桿菌表達的改良型裂解酶強于畢赤酵母。由于幽門螺桿菌本身呈透明片狀生長，且血瓊脂平板底色過深，肉眼可觀察到明顯的抑菌圈，但拍照得到的圖片無法準(zhǔn)確顯示結(jié)果。

圖7 改良型裂解酶濾紙片法抑菌效果

2.4.2 電鏡觀察 在改良型裂解酶和幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392共同搖床孵育20 min后，電鏡可觀察到幽門螺桿菌表面有明顯的孔洞，菌體周圍出現(xiàn)病變的絲狀物，整個視野里存在細(xì)菌碎片（圖8）。進一步證實了改良型裂解酶對幽門螺桿菌的裂菌作用。大腸桿菌表達的改良型裂解酶和幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392共同搖床孵育20 min時，對幽門螺桿菌產(chǎn)生的裂菌作用更強，在幽門螺桿菌表面形成的孔洞較畢赤酵母表達的改良型裂解酶更多，且更多的菌體形成球狀的近溶菌狀態(tài)，而畢赤酵母表達的改良型裂解酶作用后菌體大多仍呈桿狀。

圖8 改良型裂解酶裂解菌體電鏡圖

2.4.3 液體法抑菌試驗裂菌效果圖 幽門螺桿菌在液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，初始D600nm值為0.55，從培養(yǎng)6、24和30 h的D600nm值可以看出加入溶菌酶和改良型裂解酶的幽門螺桿菌生長受到抑制，相較于未加入二者之一的陰性對照，菌體生長差異明顯。且加入大腸桿菌表達的改良型裂解酶的幽門螺桿菌生長被抑制狀態(tài)與溶菌酶基本一致，而加入畢赤酵母表達的改良型裂解酶的幽門螺桿菌被抑制狀態(tài)稍弱于溶菌酶（圖9）。

圖9 改良型裂解酶對幽門螺旋桿菌的裂菌效果

3 討論

相對于抗生素的廣譜抗菌作用，從幽門螺桿菌噬菌體基因組獲得的裂解系統(tǒng)是特異且高效的[23]。噬菌體裂解系統(tǒng)對宿主細(xì)菌的裂解分為內(nèi)部裂解和外部裂解。外部裂解過程，即在宿主菌體外裂解細(xì)菌，主要適用于革蘭陽性細(xì)菌，因為革蘭陽性菌的肽聚糖層直接暴露于外部，有利于裂解酶和肽聚糖的直接接觸和作用；而用于革蘭陰性菌裂解酶的研究面臨很大的問題，主要原因是裂解酶的靶標(biāo)是細(xì)胞壁的肽聚糖成分，而革蘭陰性肽聚糖層周圍的細(xì)菌外膜阻礙了裂解酶與肽聚糖之間的接觸，使得它不起作用。然而，經(jīng)過研究人員的不斷研究和努力，革蘭陰性菌溶菌素的問題可以通過以下方式解決：①尋找并確定可以穿透外膜的天然裂解酶；②利用溶血素與EDTA、檸檬酸、蘋果酸和陽離子肽等外膜滲透劑的協(xié)同作用，促進裂解酶的裂解效果；③融合蛋白表達可穿透外膜的肽等[17,24]。本研究中，我們從幽門螺桿菌噬菌體KHP30中篩選得到可有效裂解幽門螺桿菌的雙組分裂解系統(tǒng)即噬菌體穴蛋白和裂解酶，通過設(shè)計改造得到改良型裂解酶基因，采用穴蛋白-裂解酶和疏水多肽的融合表達來達到穿透外膜并裂解幽門螺桿菌的效果。在以后的研究中，可以設(shè)計更多具有膜滲透性的多肽，進而篩選出融合表達后具有更好裂解效果的改良型裂解酶。

本研究分別構(gòu)建了具有裂解幽門螺桿菌作用的改良型裂解酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母X33中的表達載體，并表達出改良型裂解酶。大腸桿菌中的表達載體pSUMO-改良型裂解酶須IPTG誘導(dǎo)，在胞內(nèi)可溶性表達，需要經(jīng)過破菌處理和Ni柱純化再酶切激活，才能得到改良型裂解酶粗提物；而畢赤酵母中的表達載體pGAPZαA-改良型裂解酶無須誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，由組成型GAP啟動子表達改良型裂解酶，直接分泌到胞外，發(fā)酵上清處理后可得到改良型裂解酶粗提物。因此，畢赤酵母表達系統(tǒng)在培養(yǎng)發(fā)酵及純化方面更具優(yōu)勢，簡單方便，有利于工業(yè)規(guī)模放大生產(chǎn)。然而，體外活性檢測試驗表明在相同濃度等條件下，大腸桿菌表達系統(tǒng)所表達的改良型裂解酶的裂菌效果強于畢赤酵母表達系統(tǒng)所表達的改良型裂解酶。可能由于幽門螺桿菌與大腸桿菌均屬于原核細(xì)菌，親緣性更近，表達的作用于原核細(xì)菌的蛋白酶活性更強；而畢赤酵母表達系統(tǒng)對表達的外源蛋白可進行糖基化等修飾，可能會對改良型裂解酶的活性有所影響。研究者可根據(jù)不同的試驗需求選擇不同的表達系統(tǒng)，為治療幽門螺桿菌新型制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。自然界廣泛存在噬菌體，大量的噬菌體裂解酶有待發(fā)現(xiàn)探索。對于難以攻克的革蘭陰性菌噬菌體裂解酶，也可以通過基因重組技術(shù)設(shè)計改造，將其發(fā)展為新的生物酶抗菌制劑，用于治療新出現(xiàn)的革蘭陰性超級耐藥細(xì)菌造成的感染[12,25-26]。