炭疽芽孢桿菌新抗原NlpC的重組表達(dá)與免疫評價

胡凱，宰曉東，殷瑛，李汭樺，王美榮，李耀輝，張躍，李玉杰，辜彥霏，徐俊杰

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

［關(guān)鍵字］ 炭疽芽孢桿菌；NlpC蛋白；原核表達(dá)；免疫評價；芽孢萌發(fā)

炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）是人畜共患急性傳染病——炭疽病的病原體。人類可通過破損皮膚直接接觸、食用受污染的肉類、呼吸道吸入等途徑感染炭疽病。炭疽桿菌的芽孢具有極強的存活能力，對陽光、高溫和消毒劑均有一定的抵抗力，而且炭疽芽孢易于制備、成本低廉，多年來一直被視作潛在的生物武器進(jìn)行管控，被列為A類生物戰(zhàn)劑[1]。

疫苗是預(yù)防炭疽的有效手段，傳統(tǒng)的人用炭疽疫苗主要分為減毒活疫苗和培養(yǎng)上清吸附疫苗。減毒活疫苗以中國的A16R株和俄羅斯的STI株為代表，吸附疫苗以美國的AVA疫苗和英國的AVP疫苗為代表。這2類疫苗均存在有效保護(hù)力持續(xù)時間較短，對吸入性炭疽感染保護(hù)不佳等問題[2]。因此，研發(fā)更加安全有效的新型人用炭疽疫苗，對炭疽的預(yù)防和控制具有重要意義。

炭疽桿菌感染人體后，通過淋巴和血液循環(huán)系統(tǒng)擴散，并分泌大量的外毒素[3]。其外毒素由3種無毒蛋白組成，即保護(hù)性抗原（protective antigen，PA）、水腫因子（edema factor，EF）和致死因子（lethal factor，LF）。PA分別與LF或EF結(jié)合形成致死毒素和水腫毒素，進(jìn)而導(dǎo)致水腫和器官衰竭。PA是已知能夠發(fā)揮免疫保護(hù)作用的最主要成分，基于PA的重組蛋白疫苗顯示了較好的安全性和免疫原性，是當(dāng)前新型炭疽疫苗研究的重點方向[4-5]。但據(jù)文獻(xiàn)報道，采用毒素質(zhì)粒pXO1和莢膜質(zhì)粒pXO2均缺失的炭疽減毒菌株作為疫苗仍具有一定的保護(hù)效果，證明炭疽的其他抗原成分對免疫保護(hù)同樣發(fā)揮重要作用[6]。其中S層蛋白EA1[7]、芽孢表面蛋白BclA和BxpB[8-9]、熱激蛋白 GroEL[10]、血紅素轉(zhuǎn)運蛋白（NEAT）[11]均可以不同程度地提供保護(hù)，有望作為炭疽新型亞單位疫苗的候選組分。

NlpC（new lipoprotein C）是炭疽桿菌中的一種細(xì)胞壁水解酶，缺失后可導(dǎo)致炭疽桿菌芽孢萌發(fā)速度減緩[12]。但NlpC作為抗原是否能夠?qū)μ烤覘U菌提供保護(hù)國內(nèi)外尚無報道。本研究中，我們運用生物信息學(xué)軟件對NlpC蛋白的常規(guī)理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了NlpC蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)純化了NlpC重組蛋白，并對其免疫原性與免疫保護(hù)性進(jìn)行了初步評價，為新型炭疽亞單位疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雌性BALB/c小鼠、DBA/2小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)TOP10、BL21（DE3）購自天根生化有限公司；炭疽桿菌A16R株、質(zhì)粒pTIG為實驗室保存；2×Easy Tap PCR supermix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、EcoRⅠ，T4DNA連接酶購自NEB公司；核酸凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒、Western印跡顯影液購自賽默飛世爾科技公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、anti-6×His tag購自Abcam公司；His-tag親和層析純化柱購自通用電氣公司；TMB單組分顯色液終止液購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE預(yù)制膠購自金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.2 NlpC生物信息學(xué)分析

應(yīng)用ProtParam軟件（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測NlpC常規(guī)理化性質(zhì)；應(yīng)用SignalP-5.0 Server軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽；應(yīng)用TMHMM軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜區(qū)；應(yīng)用ProtScale軟件（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白疏水性；從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nih.gov/）下載炭疽桿菌基因組序列，應(yīng)用BLAST軟件比對NlpC氨基酸序列，分析抗原保守性。

1.3 NlpC原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以NCBI數(shù)據(jù)庫中炭疽桿菌A16R株NlpC的基因序列（AHE83353.1）為依據(jù)，去除其信號肽區(qū)域，并在C端加入His標(biāo)簽。結(jié)合表達(dá)載體pTIG的序列特點，在上下游分別添加EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點構(gòu)建引物nlpc-F、nlpc-R。在nlpc基因序列上游和pTIG載體酶切位點下游選取20 bp序列構(gòu)建鑒定引物對A-nlpc-F、A-pTIG-R。本研究所用引物均在上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 NlpC原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定引物

以炭疽桿菌A16R株基因組為模板，用nlpc-F、nlpc-R引物進(jìn)行PCR擴增nlpc基因（反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 20 s，56℃ 20 s，延伸 72℃ 1 min，40個循環(huán)），所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后用NotⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切片段通過T4DNA連接酶連接到pTIG載體，獲得NlpC表達(dá)載體pTIG-nlpc。

1.4 NlpC重組蛋白的表達(dá)

將pTIG-nlpc轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，挑取單克隆菌接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜振蕩培養(yǎng)；次日用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pTIG-nlpc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)，挑取單克隆菌接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜振蕩培養(yǎng)；次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振搖至菌液D600nm為0.6～0.8時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h；離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 NlpC重組蛋白的純化

8000 r/min離心5 min收集IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌液的菌體沉淀，用50 mL緩沖液（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH8.0）重懸，冰上超聲10 min，12 000 r/min離心10 min收集上清，經(jīng)0.22 μm針頭濾器過濾。用His親和層析柱，以梯度洗脫（洗脫液為20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH8.0）方式純化目的蛋白。SDS-PAGE鑒定純化蛋白并分析蛋白純度，BCA法定量檢測蛋白濃度。

1.6 NlpC蛋白的免疫原性評價

35只6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為7組（每組5只），經(jīng)皮下注射方式，分別聯(lián)合Al（OH）3佐劑或Al（OH）3+CpG佐劑，免疫不同劑量的NlpC（5、10、20 μg/只），設(shè)置PBS為對照組。各組于0、14、28 d進(jìn)行免疫，0、14、28、35 d采血，離心收集血清，ELISA法檢測血清中針對NlpC的特異性IgG抗體。大于陰性血清D值（D=D450nm-D630nm）2.1倍的最大稀釋度作為該樣品的抗體滴度。

1.7 炭疽芽孢的制備

將炭疽桿菌A16R株劃線法接種至LB平板，37℃過夜孵育；挑取單克隆轉(zhuǎn)接至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床中過夜培養(yǎng)；菌液接種至若干LB斜面培養(yǎng)基上，37℃孵育至菌膜基本鋪滿斜面；用1 mL生理鹽水洗下菌體，轉(zhuǎn)接至裝有LB固體培養(yǎng)基的T75羅氏瓶內(nèi)，使菌液均勻平鋪在培養(yǎng)基上，37℃正置培養(yǎng)2 h后吸出殘留的液體，倒置培養(yǎng)48 h；28℃繼續(xù)倒置培養(yǎng)10 d，用5 mL生理鹽水將菌膜洗下，再經(jīng)無菌棉片過濾后，65℃處理30 min滅活繁殖體，稀釋后涂平板計數(shù)。

1.8 芽孢萌發(fā)抑制實驗

將炭疽桿菌A16R芽孢濃度稀釋至5×105/mL，分別取10 μL芽孢加入不同稀釋度（1/1、1/5、1/20）的NlpC免疫血清（40 μL）中，未免疫血清為陰性對照。4℃孵育1 h，取5 μL菌液稀釋并滅活繁殖體后，涂LB平板計數(shù)；37℃孵箱中萌發(fā)5 min；取5 μL菌液稀釋并滅活繁殖體后，涂LB平板計數(shù)。萌發(fā)比率=陽性血清芽孢萌發(fā)率/陰性血清芽孢萌發(fā)率。

1.9 免疫攻毒實驗

32只6～8周齡雌性DBA/2小鼠隨機分為4組（每組8只），經(jīng)皮下注射方式分別免疫NlpC抗原聯(lián)合Al（OH）3+CpG佐劑或PBS（各2組）。于0、14 d進(jìn)行免疫，0、14、21 d采血，離心收集血清，ELISA法檢測血清中針對NlpC的特異性IgG抗體。首免后28 d分別用炭疽桿菌A16R株芽孢和繁殖體進(jìn)行腹腔攻毒，觀察小鼠生存情況（表2）。

表2 NlpC免疫攻毒實驗方案

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

顯著性分析采用單因素方差分析或t檢驗，生存曲線顯著性分析采用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及制圖均采用GraphPad Prism 8.0完成。

2 結(jié)果

2.1 炭疽桿菌NlpC蛋白理化性質(zhì)分析

應(yīng)用ProtParam軟件對NlpC蛋白常規(guī)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，NlpC蛋白全長為420個氨基酸，相對分子質(zhì)量43 926.74，理論等電點9.69，平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.348，不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）為8.81。應(yīng)用SignalP-5.0 Server軟件預(yù)測信號肽，其N端前26個氨基酸為其信號肽（圖1A）；應(yīng)用TMHMM軟件預(yù)測跨膜區(qū)，顯示NlpC蛋白無跨膜區(qū)（圖1B），提示NlpC是一種分泌蛋白；應(yīng)用ProtScale軟件分析蛋白疏水性，其親水性峰明顯多于疏水性峰（圖1C，小于0表示親水，大于0表示疏水），推測此蛋白為親水蛋白。對293株炭疽桿菌基因組中NlpC氨基酸進(jìn)行比對，所有氨基酸序列的相似性均在90%以上，291株序列相似性大于95%，其中完全一致的有212條（圖1D），表明NlpC具有很高的保守性。

圖1 炭疽NlpC蛋白理化性質(zhì)分析

2.2 NlpC表達(dá)質(zhì)粒pTIG-nlpc的構(gòu)建

以炭疽桿菌A16R基因組為模板擴增nlpc基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段大小約1200 bp，與理論值相符（圖2A）?；厥漳康幕蚝笥孟拗菩詢?nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ對片段和pTIG載體進(jìn)行雙酶切，酶切后的pTIG質(zhì)粒在1%瓊脂糖凝膠電泳中的移動距離比未酶切質(zhì)粒短，提示載體質(zhì)粒被雙酶切為鏈狀（圖2A）。酶切后的片段和載體經(jīng)T4DNA連接酶連接，獲得NlpC表達(dá)質(zhì)粒pTIG-nlpc（圖2B）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，涂板培養(yǎng)后挑單克隆進(jìn)行PCR菌落鑒定（圖2A），測序結(jié)果顯示插入片段序列與nlpc基因的編碼序列完全一致。

圖2 pTIG-nlpc質(zhì)粒的構(gòu)建

2.3 NlpC蛋白的表達(dá)與鑒定

將構(gòu)建的質(zhì)粒pTIG-nlpc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定結(jié)果提示NlpC實現(xiàn)了較好的可溶性表達(dá)（圖3A）。采用His親和層析柱純化NlpC蛋白后行SDS-PAGE和Western印跡鑒定，結(jié)果顯示純化的NlpC蛋白條帶單一，大小符合預(yù)期，提示獲得了NlpC蛋白，純度大于95%，可用于后續(xù)免疫評價實驗（圖3B）。

圖3 NlpC蛋白的表達(dá)與鑒定

2.4 NlpC免疫原性評價

BALB/c小鼠經(jīng)3次免疫后取血，ELISA法檢測針對NlpC的特異性抗體水平。結(jié)果顯示，單獨使用Al（OH）3佐劑時，低、中、高劑量組一免后產(chǎn)生的抗體水平較低，且低劑量組抗體水平低于中、高劑量組；二免和三免后產(chǎn)生的針對NlpC的特異性抗體水平較一免后有顯著提升（圖4A）。用Al（OH）3+CpG佐劑免疫后產(chǎn)生的針對NlpC的抗體水平顯著高于單獨使用鋁佐劑組；二免和三免后的抗體水平較一免后有顯著提升（圖4B）。

圖4 BALB/c小鼠NlpC特異性抗體水平

2.5 芽孢萌發(fā)抑制實驗

為了驗證NlpC免疫血清抑制炭疽芽孢萌發(fā)的效果，用陰性血清將NlpC免疫血清稀釋至不同濃度，與A16R株芽孢于4℃孵育，移至37℃萌發(fā)5 min，65℃處理25 min滅火繁殖體。比較不同組間萌發(fā)前后芽孢的數(shù)量，分析NlpC免疫血清對炭疽芽孢萌發(fā)的抑制情況。結(jié)果顯示，經(jīng)未稀釋的NlpC免疫血清孵育的芽孢萌發(fā)比率較陰性血清組低約50%，1/5稀釋的NlpC血清萌發(fā)比率與未稀釋NlpC血清萌發(fā)比率無差異，1/20稀釋后的NlpC血清無明顯抑制現(xiàn)象（圖5）。

圖5 芽孢萌發(fā)抑制實驗

2.6 免疫攻毒實驗

為了評價NlpC對炭疽的免疫保護(hù)效果，選用DBA/2小鼠為動物模型開展免疫攻毒實驗。分別于0、14 d免疫NlpC和PBS，首免后14、21 d檢測特異性抗體水平，28 d分別用炭疽桿菌A16R株芽孢和繁殖體進(jìn)行攻毒，觀察小鼠的生存情況。結(jié)果顯示，NlpC抗原在DBA/2小鼠中激發(fā)了顯著的體液免疫反應(yīng)，二免后抗體水平顯著高于一免，抗體效價達(dá)7.5×105（圖6A）。用炭疽桿菌A16R株繁殖體攻毒，NlpC免疫組與陰性對照組小鼠集中在1.5 d死亡（圖6B），總體平均死亡時間無統(tǒng)計學(xué)差異；用炭疽桿菌A16R株芽孢攻毒，陰性對照組的小鼠集中在2.5 d死亡，NlpC免疫組小鼠總體平均死亡時間較未免疫組推遲約24 h（圖6C），有顯著差異（P＜0.05）。

圖6 DBA/2小鼠免疫攻毒實驗

3 討論

疫苗是預(yù)防和控制炭疽的重要手段。我國上市使用的人用炭疽疫苗為無莢膜減毒株A16R，免疫方式為皮上劃痕接種，接種量難以控制，接受度普遍較低。亞單位疫苗是目前炭疽疫苗重要的研究方向，基于保護(hù)性抗原的重組疫苗顯示了較好的安全性和有效性。PA是亞單位疫苗的必要成分，但其他抗原也會以某種尚不明確的方式起著重要的保護(hù)作用，包含多種抗原的疫苗可能會提供更有效的保護(hù)[13]。炭疽桿菌NlpC蛋白是一種細(xì)胞壁水解酶，參與維持細(xì)胞壁的完整性，與炭疽芽孢的形成和萌發(fā)相關(guān)。NlpC缺失會導(dǎo)致炭疽桿菌肽聚糖的降解能力降低，芽孢萌發(fā)時間延長[12]，但NlpC作為抗原蛋白是否對炭疽桿菌具有免疫保護(hù)作用還須進(jìn)一步探究。

本研究應(yīng)用多個生物信息學(xué)軟件對NlpC蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NlpC是一種穩(wěn)定的親水性蛋白，有利于后續(xù)表達(dá)純化。用雙酶切方法構(gòu)建了NlpC原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)并純化后獲得了純度大于95%的NlpC蛋白。用純化后的NlpC蛋白聯(lián)合佐劑免疫小鼠，評價了免疫后產(chǎn)生的特異性抗體水平，發(fā)現(xiàn)NlpC具有較好的免疫原性。單獨使用Al（OH）3佐劑時，一免后產(chǎn)生的抗體水平較低，二免和三免后產(chǎn)生的特異性抗體水有顯著提升，用Al（OH）3+CpG佐劑能夠進(jìn)一步提升抗原免疫后激發(fā)的特異性抗體水平。

本研究評價了NlpC免疫血清對A16R株芽孢萌發(fā)的抑制作用，在芽孢萌發(fā)5 min時，與NlpC免疫血清孵育過的A16R株芽孢的萌發(fā)率降低了50%，證實了NlpC免疫血清對A16R株芽孢萌發(fā)具有顯著抑制作用。進(jìn)一步用免疫攻毒實驗評價NlpC誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。由于所選用的炭疽攻毒菌株A16R為減毒疫苗株，僅保留表達(dá)毒素的質(zhì)粒pXO1，因此本實驗選用對毒素更為敏感的DBA/2小鼠（補體C5缺失）用于免疫攻毒評價。NlpC在DBA/2小鼠模型中也顯示了較好的免疫原性，可激發(fā)較高的特異性抗體水平。二免后用A16R株芽孢攻毒，小鼠的死亡時間推遲了24 h，用相同劑量的A16R株繁殖體攻毒，未發(fā)現(xiàn)死亡時間推遲現(xiàn)象。結(jié)果表明NlpC免疫后小鼠生存時間延長的現(xiàn)象可能與芽孢萌發(fā)過程受到抑制相關(guān)。

不同感染途徑中，炭疽芽孢的萌發(fā)是炭疽桿菌入侵人體后至炭疽病產(chǎn)生過程的必要環(huán)節(jié)。本研究觀察到NlpC免疫血清能夠抑制炭疽芽孢萌發(fā)的速度，推遲了用芽孢攻毒后小鼠的死亡時間，是一種潛在的炭疽保護(hù)性抗原。但是NlpC免疫小鼠攻毒后仍全部死亡，推測NlpC免疫后能夠推遲芽孢萌發(fā)的時間，但無法完全抑制芽孢的萌發(fā)。NlpC雖然作為單一抗原對炭疽的保護(hù)效果有限，但推遲芽孢萌發(fā)可能會為其他保護(hù)性抗原發(fā)揮作用爭取更多的時間。此外，本研究中攻毒所用的A16R株為毒力減毒株，采用的攻毒劑量較高，現(xiàn)實感染時入侵芽孢數(shù)量更少，NlpC可能會發(fā)揮更加有效的作用。本研究為NlpC作為一種新型炭疽亞單位疫苗的有效組分研究提供了參考，NlpC聯(lián)合PA的免疫效果有待進(jìn)一步開展評價。