琯溪蜜柚果皮中黃酮的超聲輔助乙醇提取工藝

晏 幸，鐘業(yè)淵，胡 陽,2,3，魏好程,2,3，杜希萍,2,3，倪 輝,2,3，陳艷紅,2,3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

琯溪蜜柚(Citrusgrandis)原產(chǎn)于福建省平和縣，是我國著名的柚類水果。統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1]顯示，截至2016年底，僅福建省平和縣琯溪蜜柚種植面積就達(dá)43 333 hm2，年產(chǎn)量120萬t，產(chǎn)值超過50億元。琯溪蜜柚的種植已經(jīng)成為一種重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)組成，是農(nóng)民脫貧致富的重要途徑[2]。柚皮占整個柚子的43%～48%，是柚子最主要的加工副產(chǎn)物。長期以來，人們主要關(guān)注柚子果實的加工利用，卻忽略了柚皮的利用[3]，導(dǎo)致大量柚皮丟棄，不僅浪費(fèi)資源，而且會引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。隨著琯溪蜜柚加工產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，對其柚皮開展綜合利用研究顯得十分急迫。

研究[4]表明，柚皮中富含對人體有益的活性成分，如黃酮類化合物、類檸檬苦素、類胡蘿卜素、多酚等。黃酮類化合物占柚皮干重的2%～8%[5]，是柚皮的主要成分之一，其中柚皮苷是最主要的黃酮類化合物，約占其黃酮類物質(zhì)的80%[6]。柚皮苷等黃酮類化合物具有抗氧化、降血壓、抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺血、抗心律失常、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病等作用[7-11]。在食品工業(yè)上，柚皮苷可作為品質(zhì)改良劑、著色劑應(yīng)用于食品和風(fēng)味飲品的生產(chǎn)[12]；在醫(yī)藥工業(yè)上，柚皮苷可用于生產(chǎn)防治心腦血管疾病、鎮(zhèn)痛、清熱及消炎等藥物。因此，提取柚皮苷等黃酮類物質(zhì)是柚皮綜合利用的重要途徑。

目前，黃酮類化合物提取方法主要有水提法、有機(jī)溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法等[13]，其中，超聲輔助提取法與傳統(tǒng)提取方法相比，具有速度快、提取率高、溫度低、節(jié)約溶劑等特點(diǎn)，不受成分極性、分子質(zhì)量大小的限制，適用于絕大多數(shù)有效成分的提取，是一種高效、快速、節(jié)能的柚皮黃酮提取技術(shù)[14-15]。

本研究以福建省平和縣琯溪蜜柚果皮為原料，采用超聲波輔助法開展黃酮提取研究，考察各因素對總黃酮和柚皮苷提取量的影響，并測定提取得到的黃酮中柚皮苷的含量，為琯溪蜜柚果皮中黃酮類物質(zhì)的提取及利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 琯溪蜜柚購于福建省平和縣。蘆丁(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.0%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純)購自上海沃凱生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇、乙腈均為色譜級，購自美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高速粉碎機(jī)(JP-500C型)購于永康市久品工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA型)購于上海亞榮生化儀器廠；酶標(biāo)儀(Epoch 2T型)購買于美國伯騰儀器有限公司；超聲波清洗器(KQ5200DE型)購于昆山市超聲儀器有限公司；島津液相色譜儀(LC-20AT型)購于日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取及分析測定 將琯溪蜜柚清洗除雜后，剝?nèi)∑涔ぃ暨x清洗，剪成1 cm2的小塊，曬干至柚皮質(zhì)量不變?yōu)橹梗酶咚俜鬯闄C(jī)將其粉碎過100目篩。提取分析過程為：柚皮粉→超聲輔助提取→真空抽濾→濾液定容→分析測定。

1.2.2 液料比對柚皮黃酮和柚皮苷提取的影響 稱取1 g柚皮粉，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為提取溶劑，分別設(shè)定液料比(mL∶g)為5∶1、25∶1、45∶1、65∶1、85∶1 ，在25 ℃、超聲頻率100 W的條件下超聲提取50 min，趁熱進(jìn)行抽濾，收集提取液用超純水定容至100 mL，測定總黃酮及柚皮苷含量。

1.2.3 提取時間對柚皮黃酮和柚皮苷提取的影響 稱取1 g柚皮粉，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為提取溶劑，液料比(mL∶g)為45∶1，提取溫度為25 ℃，超聲頻率為100 W，分別提取10，30，50，70，90 min，樣品超聲后趁熱進(jìn)行抽濾，收集提取液用超純水定容至100 mL，測定總黃酮含量及柚皮苷含量。

1.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對柚皮黃酮和柚皮苷提取的影響 稱取1 g柚皮粉，在液料比(mL∶g)為45∶1，提取時間為50 min，提取溫度為25 ℃，超聲頻率為100 W條件下，分別采用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇進(jìn)行提取，樣品超聲后趁熱進(jìn)行抽濾，收集提取液用超純水定容至100 mL，測定總黃酮含量及柚皮苷含量。

1.2.5 提取次數(shù)對柚皮黃酮提取的影響 稱取1 g柚皮粉，在液料比(mL∶g)為45∶1、提取時間為50 min、提取溫度為 25°C、超聲頻率為100W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下提取柚皮黃酮，將提取液在溫度為20 ℃、時間為5 min、轉(zhuǎn)速為5500 r/min的條件下離心取上清液。取第一次提取后的沉淀/殘渣按照第一次提取相同的工藝進(jìn)行第二次提取，得到提取上清液。之后，殘渣不斷進(jìn)行重復(fù)提取，直至上清液吸光度值與體積分?jǐn)?shù)70%乙醇空白溶液的一樣，即代表柚皮中所有黃酮被完全提取出來。按下式計算多次提取得到的黃酮總量：黃酮總量/(mg·g-1)=m1+m2+m3+m4+m5。其中：m1為第1次提取出的黃酮量；m2為第2次提取出的黃酮量；m3為第3次提取出的黃酮量；m4為第4次提取出的黃酮量；m5為第5次提取出的黃酮量，單位均為mg/g。

1.2.6 總黃酮及柚皮苷含量測定方法的建立

1.2.6.1 總黃酮含量測定方法 取5 mL提取液于25 mL比色管中，向其中加入2 mL 體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液，充分搖勻，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液，混勻后靜置5 min。再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液，搖勻后放置5 min，然后加入10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH搖勻，加入體積分?jǐn)?shù)30%乙醇定容到25 mL，充分搖勻并靜置15 min，測定510 nm的吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線按照式(1)[16]計算提取液中黃酮的提取量。其中，測定得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程Y=1.556 5X+0.012 9。

黃酮提取量X/(mg·g-1)=(C×V1×V2)/(m×V0)，

(1)

式中：C為由回歸方程算得的樣液濃度(g/L)；V1為測定時的定容體積(mL)；V2為提取液定容體積(mL)；m為稱取樣品質(zhì)量(g)；V0為用于測定的提取液體積(mL)。

1.2.6.2 柚皮苷含量測定方法 取10 mL定容后的提取液，旋蒸至干，加入10 mL甲醇并超聲波輔助溶解，過0.20 nm濾膜進(jìn)行液相色譜分析。色譜柱為AlltimaTM C18Column(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為V(超純水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=62∶12∶26；檢測波長為283 nm；流速為0.6 mL/min；柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，洗脫時間為25 min。根據(jù)柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=27 562.9X-68 552，按下式計算柚皮苷含量：

柚皮苷含量X/(mg·g-1)=cV/(1000m)，

(3)

式中：X為試樣中被測組分含量(mg/g)；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到被測組分溶液的濃度(mg/L)；V為樣品溶液定容體積(mL)；m為樣品溶液所代表試樣的質(zhì)量(g)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 應(yīng)用Office Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用SPSS 19.0軟件中的單因素中的Duncan檢驗進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對柚皮中黃酮和柚皮苷提取的影響

由圖1可知，總黃酮和柚皮苷的提取量隨著液料比升高而增大，并在液料比(mL∶g)為45∶1時達(dá)到最大值，總黃酮和柚皮苷的最大提取量分別為30.44和19.56 mg/g。但隨著液料比進(jìn)一步升高，總黃酮提取量趨于穩(wěn)定。相關(guān)文獻(xiàn)[17]表明，增大溶劑量會導(dǎo)致黃酮類化合物分子傳質(zhì)到溶液中的總量增加，當(dāng)提取物達(dá)到平衡后，繼續(xù)增大溶劑量會增加雜質(zhì)的浸出。因此，柚皮黃酮提取選擇液料比(mL∶g)為45∶1比較合適。此外，當(dāng)液料比(mL∶g)大于45∶1時，對黃酮提取量無顯著性影響(P≤0.05)，柚皮苷提取量隨提取液料比增加而緩慢降低(P≤0.05)。倪明等[18]采用超聲波微波組合提取柚皮總黃酮，其優(yōu)化的液料比(mL∶g)為80∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，超聲波功率為300 W，微波功率為900 W，提取時間為2 min。劉英等[19]采用超聲輔助提取柚皮中柚皮苷，優(yōu)化的液料比(mL∶g)為30∶1，提取時間為1 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取溫度為50 ℃，提取功率為25 W。對比相關(guān)文獻(xiàn)，本實驗的液料比小于文獻(xiàn)[18]的研究結(jié)果，但大于文獻(xiàn)[19]的結(jié)果。

2.2 提取時間對柚皮黃酮和柚皮苷提取的影響

由圖2可知，隨著提取時間的增加，總黃酮和柚皮苷提取量增大，在提取時間為50 min時達(dá)到最大，總黃酮和柚皮苷的最大提取量分別為29.05和20.76 mg/g。但隨著時間進(jìn)一步延長，總黃酮和柚皮苷提取量呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)提取時間為50 min的時候，黃酮提取量最大，繼續(xù)增加提取時間，黃酮提取量顯著降低(P≤0.05)。柚皮苷提取量隨提取時間的變化規(guī)律與黃酮提取量變化規(guī)律相同。陳文娟等[20]采用熱浸提法提取漳州血柚皮中的總黃酮，最優(yōu)提取時間為2.5 h。郭俊俊等[21]使用乙醇浸提法提取柚皮中的黃酮類化合物，最優(yōu)提取時間為2 h。謝勇武等[22]采用植物纖維素酶提取柚皮中總黃酮，最優(yōu)提取時間為90 min。公衍玲等[23]采用乙醇回流法提取柚皮中總黃酮，得到的最優(yōu)提取時間為95 min。很顯然，本研究的提取時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以上相關(guān)研究報道的柚皮黃酮提取時間，其原因可能是本實驗采用了超聲輔助提取，縮短了黃酮提取時間。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對柚皮中黃酮和柚皮苷提取的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高，總黃酮和柚皮苷提取量先增大而后變小，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，總黃酮和柚皮苷提取量達(dá)到最大，分別為30.12和19.15 mg/g。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～90%的范圍內(nèi)，柚皮總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而逐漸減小，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增加，柚皮黃酮類化合物的溶解度變小所致。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，黃酮和柚皮苷的提取量顯著高于其他乙醇體積分?jǐn)?shù)的提取量(P≤0.05)。

魏強(qiáng)華等[24]在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、液料比(mL∶g)為20∶1、提取時間為60 min、提取溫度為40 ℃的條件下從柚皮中提取柚皮苷，平均提取量為33.80 mg/g。于桂香等[25]在乙醇體積分?jǐn)?shù)為82%、超聲時間為45 min、提取溫度為61.5 ℃的條件下提取柚皮黃酮，提取率為6.667 mg/g。馬亞琴等[26]在甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%、溫度為40 ℃、超聲功率為8 W、超聲時間為30 min、液料比(mL∶g)為20∶1的條件下提取柚皮中的柚皮苷，提取率約為5%。相比之下，本實驗的乙醇體積分?jǐn)?shù)低于大部分研究優(yōu)化的結(jié)果。

2.4 提取次數(shù)對總黃酮的影響

表1 提取次數(shù)對琯溪蜜柚果皮中黃酮的影響Tab.1 Effect of repeat times on extraction rate oftotal flavone from Guanxi honey pummelo peel提取次數(shù)Extraction times黃酮提取量/(mg·g-1) Extraction amount of flavone黃酮提取率/%Extraction rate of flavone132.37±0.1945.79±0.005214.59±0.3720.65±0.004312.02±0.4917.01±0.002411.70±0.1916.56±0.001500柚皮中總黃酮提取量Total flavone extractedfrom pomelo peel70.69±0.98—

在液料比為45∶1、提取時間為50 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下對柚皮中的黃酮進(jìn)行多次重復(fù)提取，結(jié)果如表1所示?？梢?，第1次黃酮提取量為32.37 mg/g，之后，每次提取量隨提取次數(shù)增加而逐漸下降，至第5次提取時，提取液中已經(jīng)檢測不出黃酮類物質(zhì)。計算前4次琯溪蜜柚果皮中黃酮提取量為70.69 mg/g，約占柚皮7.07%。王曉君等[27]采用微波輔助復(fù)合酶法提取臍橙皮中的總黃酮，每100 g得到的黃酮提取量為3.96 g(約3.96%)；公衍玲等[23]在乙醇體積分?jǐn)?shù)為76%、液料比為20∶1、回流提取為2次、回流時間為95 min、回流溫度為90 ℃的條件下提取柚皮黃酮，得率為1.036%。相比之下，本實驗從琯溪蜜柚果皮中提取得到的黃酮得率遠(yuǎn)高于其他柚類黃酮的提取得率。

2.5 琯溪蜜柚黃酮提取物中柚皮苷含量的分析

采用HPLC測定琯溪蜜柚提取物中柚皮苷含量，色譜圖如圖4所示，通過分析得到柚皮苷占黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為64.27%。盛雪飛等[28]水浴提取胡柚得到黃酮含量為385.61 mg/g，柚皮苷含量為220.87 mg/g，所得柚皮苷占黃酮的57.27%。趙紅英等[29]采用超聲法提取不同栽培品種化州柚的黃酮含量為19.42%，柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.72%，提取的柚皮苷含量占黃酮含量的60.35%。相比之下，本實驗從琯溪蜜柚皮中提取的柚皮苷含量占黃酮的比例高于其他研究的結(jié)果。

3 結(jié)論

本實驗運(yùn)用超聲輔助提取法提取柚皮總黃酮及柚皮苷，優(yōu)化的提取工藝條件為：液料比(mL∶g)為45∶1 ，超聲時間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，重復(fù)提取4次，黃酮提取量為70.69 mg/g，提取得到的黃酮中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到64.27%。