皺紋盤(pán)鮑基質(zhì)金屬蛋白酶基因的克隆與表達(dá)分析

陳玉磊，李婉玉，吳裕玲，楊汝晴，章 騫,2， 張凌晶，劉光明,2，曹敏杰,2

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021； 2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

鮑魚(yú)隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)、鮑屬(Haliotis)，自古以來(lái)就被認(rèn)為是海洋中最珍貴的美味。鮑魚(yú)已經(jīng)成為全球水產(chǎn)養(yǎng)殖的一種重要經(jīng)濟(jì)品種[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年我國(guó)鮑魚(yú)產(chǎn)量達(dá)到近14萬(wàn)t，比2014年增長(zhǎng)9.2%。福建省作為鮑魚(yú)養(yǎng)殖大省，年產(chǎn)量占全國(guó)81%[2]。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，質(zhì)量管理、疾病預(yù)防與控制等相關(guān)技術(shù)的缺乏容易導(dǎo)致鮑魚(yú)疾病的流行，其中，副溶血性弧菌是導(dǎo)致養(yǎng)殖鮑魚(yú)成活率下降的主要病原菌。感染了副溶血性弧菌的鮑魚(yú)表現(xiàn)為萎縮，從受疾病感染的鮑魚(yú)多樣性血淋巴中分離出的副溶血性弧菌可導(dǎo)致幼年鮑魚(yú)的死亡[3]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類(lèi)活性依賴(lài)于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶[4]。典型的MMPs結(jié)構(gòu)包括：1)疏水信號(hào)肽序列；2)前肽區(qū)，主要作用是保持酶原的穩(wěn)定，當(dāng)該區(qū)域被外源性酶切斷后，MMPs酶原被激活；3)催化活性區(qū)，有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)酶催化作用的發(fā)揮至關(guān)重要；4)富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)；5)類(lèi)血紅素結(jié)合區(qū)，與酶的底物特異性有關(guān)[5]。不同的MMP具有不同的底物特異性。MMPs的表達(dá)由糖皮質(zhì)激素、類(lèi)維生素A、病菌感染和外界壓力等因素調(diào)控[6]，其活性受轉(zhuǎn)錄水平、酶原激活和天然抑制劑(tissue inhibitors of MMPs，TIMP)的嚴(yán)格控制[7]。作為降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要酶類(lèi)，MMPs能夠參與生物體多種生理和病理過(guò)程，如胚胎發(fā)育、組織重排、免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生等[8-9]。目前，對(duì)MMPs的研究主要集中于哺乳動(dòng)物，以水產(chǎn)動(dòng)物特別是貝類(lèi)為研究對(duì)象的報(bào)道較少。因此，本文以皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)為研究對(duì)象，克隆得到3個(gè)MMPs(Hdh-MMP-16/17/21)部分基因序列，并對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。還對(duì)Hdh-MMPs在皺紋盤(pán)鮑不同組織中的相對(duì)表達(dá)量及其在副溶血弧菌感染前后基因相對(duì)表達(dá)量變化情況進(jìn)行了初步試驗(yàn)，以探究MMPs在皺紋盤(pán)鮑免疫調(diào)控環(huán)節(jié)中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大小均一的健康皺紋盤(pán)鮑購(gòu)于廈門(mén)市夏商國(guó)際水產(chǎn)交易中心，平均質(zhì)量約40 g，于20 ℃暫養(yǎng)3～4 d后根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理。養(yǎng)殖用海水取于集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖場(chǎng)，每12 h更換一次。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及致病菌處理

實(shí)驗(yàn)用皺紋盤(pán)鮑暫養(yǎng)后，隨機(jī)挑取3只鮑魚(yú)，收集血淋巴細(xì)胞、肝胰腺、鰓、肌肉、腹足、外套膜和性腺，不同個(gè)體相同組織混合后置于液氮備用。將剩余鮑魚(yú)隨機(jī)分為兩組，每組20只，試驗(yàn)組注射副溶血弧菌(2×107CFU)，對(duì)照組注射同等體積磷酸緩沖液。注射12、24、48和72 h后，分別隨機(jī)挑取3只鮑魚(yú)，收集鮑魚(yú)主要免疫器官(血淋巴細(xì)胞、鰓、肝胰腺)，不同個(gè)體相同組織混合后置于液氮備用。

1.3 總RNA的提取及cDNA合成

按總RNA提取試劑盒(Tiangen)提供的方法提取各組織(血淋巴細(xì)胞、肝胰腺、鰓、肌肉、腹足、外套膜和性腺)的總 RNA。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的完整性，使用NanoDrop ND1000檢測(cè)RNA濃度及純度。利用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)將血淋巴細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄成用于基因克隆的cDNA。將不同組織mRNA濃度調(diào)為一致，利用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)合成用于熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)的cDNA。

1.4 皺紋盤(pán)鮑MMPs 基因克隆

通過(guò)拼接NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中皺紋盤(pán)鮑轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：SRP059307)，得到完整的皺紋盤(pán)鮑轉(zhuǎn)錄組序列。利用BLAST在線軟件預(yù)測(cè)得到與其他物種MMP同源的Hdh-MMP-16/17/21基因部分序列。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)Hdh-MMPs特異性引物(見(jiàn)表1)，以皺紋盤(pán)鮑血淋巴細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)如下：Taq酶 0.2 μL， 10×buffer 2.0 μL，dNTP(10 mmol/L)2.0 μL，正向引物(10 μmol/L)1.0 μL，反向引物(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。 將3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠，并進(jìn)行電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒(Tiangen)回收后，連接pEASY-T1載體(TransGen Biotech)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和菌落PCR，挑取陽(yáng)性菌落送廈門(mén)鉑瑞生物科技有限公司測(cè)序。

表1 基因克隆所用引物

1.5 生物信息學(xué)分析

根據(jù)克隆得到的Hdh-MMPs基因序列，利用DNAMAN軟件推導(dǎo)Hdh-MMPs氨基酸序列；利用interpro在線分析軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；用 NCBI 中 BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對(duì)和相似性分析；用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；通過(guò)PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線預(yù)測(cè)MMPs蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行不同物種間同一基因多序列比對(duì)。

1.6 qPCR檢測(cè)Hdh-MMPs基因表達(dá)

根據(jù)克隆得到的皺紋盤(pán)鮑Hdh-MMPs基因序列設(shè)計(jì)qPCR用引物(見(jiàn)表2)，以 EF-1α作為內(nèi)參基因，利用TransStart?Top Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech)分析Hdh-MMPs基因在皺紋盤(pán)鮑各組織及副溶血弧菌感染前后的表達(dá)差異性。qPCR反應(yīng)體系(10 μL)如下：2×qPCR SuperMix 5 μL，正向引物(10 μmol/L)0.2 μL，反向引物(10 μmol/L)0.2 μL，50×Passive Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。于ABI 7300儀器(Applied Biosystems)中進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增，程序如下：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃延伸31 s(熒光采集)，循環(huán)40次；擴(kuò)增結(jié)束后，從55 ℃升溫至94 ℃制備溶解曲線。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每組反應(yīng)均設(shè)置無(wú)模板對(duì)照。

表2 qPCR所用引物

1.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Graphpad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)及圖表繪制，采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 Hdh-MMPs基因的克隆及序列分析

通過(guò)拼接NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中皺紋盤(pán)鮑轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：SRP059307)[10]，得到完整的皺紋盤(pán)鮑轉(zhuǎn)錄組序列。利用BLAST在線軟件預(yù)測(cè)得到與其他物種MMP同源的Hdh-MMP-16/17/21基因部分序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增，克隆得到Hdh-MMP-16、Hdh-MMP-17和Hdh-MMP-21 cDNA編碼區(qū)部分序列。Hdh-MMP-16片段長(zhǎng)度1150 bp，編碼383個(gè)氨基酸殘基，包含MMP完整的催化區(qū)和肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖1a)。Hdh-MMP-17和Hdh-MMP-21片段長(zhǎng)度分別為1913 bp和2112 bp，分別編碼636和703個(gè)氨基酸殘基，包含MMP完整的催化區(qū)、肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域和類(lèi)血紅素結(jié)合區(qū)(見(jiàn)圖1b和圖1c)。氨基酸序列分析表明，Hdh-MMP-16/17/21 3個(gè)蛋白質(zhì)均含有保守結(jié)構(gòu)片段，即位于催化結(jié)構(gòu)域的催化活性中心HEXGHXXGXXH序列(見(jiàn)圖1)。

2.2 Hdh-MMPs蛋白質(zhì)特性和結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果，克隆得到的Hdh-MMP-16蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為42.28 ku，理論等電點(diǎn)為9.39。基因編碼的383個(gè)氨基酸中，帶有正電荷的堿性氨基酸精氨酸(Arg)和賴(lài)氨酸(Lys)共52個(gè)，帶有負(fù)電荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共42個(gè)。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)和疏水值分別為 33.89 和-0.670，是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。使用PSIPRED對(duì)Hdh-MMP-16二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，α-螺旋結(jié)構(gòu)占15.4%，β-折疊占6.0%，無(wú)規(guī)則卷曲占78.6%。

預(yù)測(cè)Hdh-MMP-17蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為73.15 ku，理論等電點(diǎn)為8.60?；蚓幋a的636個(gè)氨基酸中，帶有正電荷的堿性氨基酸精氨酸(Arg)和賴(lài)氨酸(Lys)共80個(gè)，帶有負(fù)電荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共72個(gè)。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)和疏水值分別為40.02和-0.367，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Hdh-MMP-17蛋白質(zhì)中，α-螺旋結(jié)構(gòu)占19.5%，β-折疊占12.7%，無(wú)規(guī)則卷曲占67.8%。

預(yù)測(cè)Hdh-MMP-21蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為82.36 ku，理論等電點(diǎn)為8.55?；蚓幋a的703個(gè)氨基酸中，帶有正電荷的堿性氨基酸精氨酸(Arg)和賴(lài)氨酸(Lys)共108個(gè)，帶有負(fù)電荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共101個(gè)。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)和疏水值分別為 42.76 和-0.839，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。Hdh-MMP-21蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為：α-螺旋結(jié)構(gòu)占14.8%，延伸鏈占12.5%，無(wú)規(guī)則卷曲占72.7%。

2.3 Hdh-MMPs氨基酸序列比對(duì)及序列相似性分析

通過(guò)NCBI在線BLAST工具進(jìn)行Hdh-MMP氨基酸序列相似性搜索，結(jié)果表明，Hdh-MMP-16/17/21序列與多種物種的MMP-16/17/21具有序列相似性，表明MMP在不同物種間較保守。進(jìn)而利用DNAMAN軟件對(duì)不同物種MMP-16/17/21氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，Hdh-MMP-16 氨基酸序列與緬甸蟒蛇(Pythonbivittatus，XP_015745754.1)、紅頭美洲鷲(Cathartesaura，KFP55131.1)和白尾海雕(Haliaeetusalbicilla，XP_009910615.1)MMP-16的同源性分別為32%、32%和31%(見(jiàn)圖2a)；Hdh-MMP-17 的氨基酸序列與太平洋牡蠣(Crassostreagigas，EKC39793.1)、雙胸斑沙鳥(niǎo)(Charadriusvociferus，XP_009886438.1)和波斑鴇(Chlamydotismacqueenii，KFP39531.1)MMP-17的序列相似性分別為43%、33%和33%(見(jiàn)圖2b)；Hdh-MMP-21氨基酸序列與光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata，XP_013079423.1)、蝦夷盤(pán)扇貝(Mizuhopectenyessoensis，OWF51000.1)和美洲牡蠣(Crassostreavirginica，XP_022341852.1)MMP-21的序列相似性分別為47%、43%和46%(見(jiàn)圖2c)。

2.4 Hdh-MMPs基因在皺紋盤(pán)鮑不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中以熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，可通過(guò)內(nèi)參或外參法定量分析樣品中的特定DNA序列。本研究利用qPCR檢測(cè)Hdh-MMPs基因在皺紋盤(pán)鮑不同組織中表達(dá)量差異，探究MMPs在皺紋盤(pán)鮑體內(nèi)的組織分布情況。結(jié)果顯示，Hdh-MMP-16/17/21基因在檢測(cè)的不同組織均有不同程度的表達(dá)。其中，Hdh-MMP-16在血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量最高，其次為肝胰腺和外套膜，在其他組織中表達(dá)水平較低(見(jiàn)圖3a)。Hdh-MMP-17在血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量最高，其次為鰓、腹足、性腺和外套膜，肝胰腺和肌肉中表達(dá)量較低(見(jiàn)圖3b)。Hdh-MMP-21在鰓中表達(dá)量最高，其次為性腺和肌肉，在其他組織中表達(dá)量較低(圖3c)。

2.5 Hdh-MMPs在皺紋盤(pán)鮑感染弧菌前后表達(dá)量差異的分析

近年來(lái)研究表明，MMP參與調(diào)控機(jī)體抗菌和抗病毒先天性免疫反應(yīng)。本研究中，將副溶血弧菌以肌肉注射的方式感染鮑魚(yú)，并檢測(cè)感染不同時(shí)間后鮑魚(yú)主要免疫器官肝胰腺、鰓、血淋巴細(xì)胞中Hdh-MMPs基因相對(duì)表達(dá)量變化情況，如圖4a～圖4c所示?？梢?jiàn)，與PBS組對(duì)比，副溶血弧菌感染后鰓中Hdh-MMP-16表達(dá)量整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而在血淋巴細(xì)胞和肝胰腺中則與對(duì)照組接近。Hdh-MMP-17相對(duì)表達(dá)量在弧菌感染后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在肝胰腺和鰓中，Hdh-MMP-17相對(duì)表達(dá)量在注射后12 h達(dá)到最高值；而在血淋巴細(xì)胞中，在注射后48 h達(dá)到最高值(圖4d～圖4f)。弧菌感染后，鰓和肝胰腺中的Hdh-MMP-21基因一定程度上調(diào)表達(dá)，而血淋巴細(xì)胞中該基因表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)異(圖4g～圖4i)。綜上所述，Hdh-MMP-16/17/21可能與鮑魚(yú)抵御病原菌入侵的先天免疫性調(diào)控相關(guān)。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)型內(nèi)肽酶，它是降解ECM的主要酶類(lèi)，能夠參與生物體多種生理和病理過(guò)程[11-12]。截至目前，已發(fā)現(xiàn)了至少26種結(jié)構(gòu)與功能各異的MMP，根據(jù)其細(xì)胞亞定位可分為分泌型MMPs和膜型MMPs(membrane-type MMPs，MT-MMPs)。新合成的MMP以酶原的形式存在，當(dāng)其前肽區(qū)被剪切后，酶原得以活化。而后，基質(zhì)金屬蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)結(jié)合在活化的MMP的活性位點(diǎn)，從而影響其酶活性[13]。在前期研究中，本課題組已從鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)和刺參(Stichopusjaponicus)中克隆得到MMP-2基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)異源表達(dá)得到具有活性的MMP-2催化結(jié)構(gòu)域，并探索了MMP-2降解膠原蛋白的特性[14-15]；從皺紋盤(pán)鮑中克隆得到MMP-1基因全長(zhǎng)序列，但是并未獲得具有酶解活性的MMP-1蛋白質(zhì)[16]。已有研究報(bào)道，哺乳動(dòng)物中多種MMP(如MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-17和MMP-25等)可以直接或間接影響機(jī)體內(nèi)參與炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)的細(xì)胞因子與趨化因子的活性，其中MMP-7能直接殺死入侵的病原菌[17-18]。此外，巨噬細(xì)胞分泌的MMP-12能被運(yùn)輸?shù)礁腥玖瞬《镜乃拗骷?xì)胞內(nèi)，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子起始NFKBIA 基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致IFN-α的大量分泌并發(fā)揮保護(hù)宿主的作用[9]。因此，除了參與胞外基質(zhì)的降解，MMP在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和先天性免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。本研究克隆得到皺紋盤(pán)鮑3個(gè)MMPs基因(Hdh-MMP-16/17/21)部分序列，序列分析結(jié)果表明，該3個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)含有MMP典型的催化結(jié)構(gòu)域和類(lèi)血紅素結(jié)合區(qū)。催化活性中心HEXGHXXGXXH 3個(gè)組氨酸殘基(H)與Zn2+形成的配位鍵是MMP發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵。多序列比對(duì)結(jié)果表明，Hdh-MMPs蛋白質(zhì)與某些軟體動(dòng)物的MMPs具有序列相似性，而Hdh-MMP-17還和人MMP-17蛋白質(zhì)具有較高的同源性，表明結(jié)構(gòu)相似的MMPs在不同物種間較保守。

MMP-16(membrane-type 3 MMP，MT3-MMP)和MMP-17(membrane-type 4 MMP，MT4-MMP)屬于膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，可在細(xì)胞邊緣降解ECM，從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化和遷移等活性。MMP-16是I型跨膜基質(zhì)金屬蛋白酶，在正常的成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)。它不僅可以降解Ⅲ型膠原蛋白、聚糖、明膠和纖連蛋白等，還可一定程度上激活MMP-2，隨著蛋白酶原從細(xì)胞排出而進(jìn)入其活性形式。MMP-16的活性受TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4嚴(yán)格調(diào)控。有趣的是，在低濃度TIMP-2作用下，MMP-16激活MMP-2酶原的活性顯著提高，這一作用可能與三元復(fù)合物的形成有關(guān)[19]。已有研究表明，MMP-16不僅參與晚期軟骨細(xì)胞分化、椎間盤(pán)退變等過(guò)程[20-21]，同時(shí)也參與上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移[22]。與MMP-16不同的是，MMP-17通過(guò)與糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)結(jié)合而錨定在細(xì)胞膜上，因此被稱(chēng)為GPI固定化蛋白，其活性主要受TIMP-1和TIMP-2調(diào)控[23]。MMP-17缺陷型小鼠并未呈現(xiàn)出明顯的病態(tài)，說(shuō)明MMP-17缺失不影響機(jī)體的正常發(fā)育和個(gè)體存活[24]。在軟骨關(guān)節(jié)炎、乳腺癌和頭頸癌等病人樣品中MMP-17大量表達(dá)，表明MMP-17與疾病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[23]。脂多糖刺激之后，馬氏珠母貝MMP-17基因表達(dá)水平在12 h后達(dá)到最大值，之后逐漸下降至正常水平[25]。本研究結(jié)果顯示，Hdh-MMP-16在皺紋盤(pán)鮑血淋巴細(xì)胞和肝胰腺中表達(dá)量最高，而Hdh-MMP-17在血淋巴細(xì)胞和鰓中表達(dá)量最高。由于血淋巴細(xì)胞、鰓和肝胰腺是鮑魚(yú)主要的免疫器官，Hdh-MMPs在這些組織中的高表達(dá)可能與皺紋盤(pán)鮑的先天免疫相關(guān)。致病菌感染機(jī)體后，皺紋盤(pán)鮑鰓組織中MMP-16轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，但血淋巴細(xì)胞和肝胰腺中MMP-16轉(zhuǎn)錄水平基本無(wú)變化。Hdh-MMP-17在血淋巴細(xì)胞、鰓和肝胰腺中表達(dá)量均一定程度上調(diào)。已有研究表明，副溶血弧菌主要侵染鮑魚(yú)的血竇和鰓上皮細(xì)胞[26]。用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記的副溶血弧菌感染鮑魚(yú)后，其主要粘附和進(jìn)入鰓組織[27]。鮑魚(yú)的肝胰腺也是非常重要的免疫器官，其分泌的多種蛋白酶可通過(guò)水解作用來(lái)抵御病原菌的侵染[28]。因此，弧菌感染鮑魚(yú)后鰓組織中Hdh-MMP-16表達(dá)量的上調(diào)以及三個(gè)免疫器官中Hdh-MMP-17表達(dá)量的上調(diào)可能與宿主抗病原菌感染有關(guān)。

MMP-21屬于轉(zhuǎn)化酶激活的基質(zhì)金屬蛋白酶，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。與其他MMPs不同的是，MMP-21主要由上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)與分泌，表明MMP-21的主要作用是參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[29]。本研究結(jié)果顯示，Hdh-MMP-21在上皮細(xì)胞豐富的鰓組織中表達(dá)量最高，這與MMP-21的表達(dá)特性相一致。此外，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)可以在幾種正常的人體組織中檢測(cè)到MMP-21的轉(zhuǎn)錄本，這些組織包括腎臟、胎盤(pán)、腦、肺和白細(xì)胞等，說(shuō)明MMP-21可能在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和代謝過(guò)程中發(fā)揮一定作用[30]。已有研究顯示，斑馬魚(yú)中MMP-21基因表達(dá)的抑制能顯著影響斑馬魚(yú)心臟環(huán)化[31]。由于鮑魚(yú)肌肉中富含膠原蛋白，其含量直接影響肌肉嫩度[32]。在本研究中，肌肉組織中表達(dá)量較高的MMP-21可能參與膠原蛋白的新陳代謝，進(jìn)而影響鮑魚(yú)肌肉質(zhì)構(gòu)。此外，副溶血弧菌感染12 h后，鰓和肝胰腺中Hdh-MMP-21表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明其也可能參與皺紋盤(pán)鮑抗菌感染的早期階段。

為了進(jìn)一步探索Hdh-MMPs在皺紋盤(pán)鮑先天性免疫中的作用，下一步需體外表達(dá)Hdh-MMPs重組蛋白并制備特異性多克隆抗體，通過(guò)檢測(cè)Hdh-MMPs在皺紋盤(pán)鮑不同組織和弧菌感染前后各組織蛋白水平的變化情況，進(jìn)一步闡明Hdh-MMPs在鮑魚(yú)體內(nèi)的存在形式及其參與非特異免疫應(yīng)答的機(jī)制。