Epstein-Barr病毒感染相關(guān)性肝損傷對(duì)循環(huán)血T淋巴細(xì)胞亞群影響的相關(guān)性分析

戢敏，陳星，喻雪琴，陳芳，梅怡晗，梅小平

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種經(jīng)呼吸道傳染的DNA 皰疹病毒，在淋巴細(xì)胞內(nèi)可長(zhǎng)期潛伏存在，該病毒除可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis, IM）外，也可引起急、慢性肝炎[1]，這可能與EBV 感染后肝細(xì)胞水腫、氣球樣變性或點(diǎn)狀壞死、肝竇內(nèi)以淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)等關(guān)系密切。有學(xué)者研究表明，EBV 病毒感染后所致肝損傷及程度與EBV 單獨(dú)感染、合并感染形式及免疫功能狀態(tài)有著密切關(guān)系[2]。本文就56 例EBV 感染及感染狀態(tài)所致相關(guān)性肝損傷患者進(jìn)行回顧性分析，旨在了解單純EBV 感染及合并其他病毒感染相關(guān)性肝損傷及程度與T 淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平變化的相關(guān)性，為早期護(hù)肝、抗病毒治療及免疫調(diào)節(jié)治療提供一定的理論參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年6月—2018年8月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院診斷為EBV 感染相關(guān)性肝損傷的56 例患者。其中，男性30 例，女性26 例；年齡10～60 歲，中位年齡35.7 歲。其中，單純EBV 感染相關(guān)性肝損傷的患者36 例（單純EBV 感染組）：男性20 例，女性16 例；年齡10～58 歲，中位年齡35.3 歲；合并其他病毒感染相關(guān)性肝損傷患者20 例（EBV 合并感染組）：男性12 例，女性8 例；年齡10～60 歲，中位年齡35.9 歲。診斷需符合下列2 條之一：①血清學(xué)抗體檢測(cè)提示急性EBV 感染或慢性感染急性發(fā)作伴有肝損傷并達(dá)到肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；②分子生物學(xué)方法包括PCR、原位雜交和Southern 雜交從患者血清檢測(cè)EBV-DNA 陽性伴有肝損傷并達(dá)到肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)選取同期20 例體檢者為健康對(duì)照組。其中，男性11 例，女性9 例；年齡11～60 歲，中位年齡34.8 歲，3 組性別構(gòu)成比、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

EBV 感染診斷需具備下列條件：①有典型臨床表現(xiàn)和體征，如發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大、皮疹等；②循環(huán)血常規(guī)異型淋巴細(xì)胞＞10%；③EBV衣殼抗原IgM（抗EBV-IgM）陽性；④肝功能損傷是指谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高4 倍以上，伴或不伴膽紅素明顯升高[3]，肝功能損傷由嗜肝或非嗜肝病毒感染所致，已排除藥物、細(xì)菌、真菌、自身免疫因素等所致肝損傷。

1.3 治療方法

所有EBV 相關(guān)性肝損傷患者入院后予臥床休息、調(diào)控體溫及預(yù)防感染等對(duì)癥治療，由于是發(fā)病早期（病程的前1 或2 天），均使用阿昔洛韋靜脈滴注治療，療程3～5 d。同時(shí)給與復(fù)方甘草酸苷針進(jìn)行保肝治療至肝功能正常，所有患者均在持續(xù)治療第7天時(shí)采取靜脈血做肝損傷指標(biāo)與T 淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)檢測(cè)?；颊咴隗w溫正常，肝功能正常后出院。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 標(biāo)本采集 EBV 感染相關(guān)性肝損傷患者與健康對(duì)照組均于入院及體檢當(dāng)天采取循環(huán)靜脈血分離血漿，并進(jìn)行游離EBV-DNA 載量、肝功能、T 淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)等檢測(cè)；EBV 感染相關(guān)肝損傷患者采取循環(huán)靜脈血進(jìn)行甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、科薩奇B 組病毒及自免肝等檢測(cè)，治療7 d 后再進(jìn)行游離EBVDNA 載量、肝功能、T 淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)等檢測(cè)。

1.4.2 循環(huán)血T 細(xì)胞亞群檢測(cè) 取循環(huán)靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。在各試管中加入10 μl 由CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC 和CD3-FITC/ CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC 組成的四標(biāo)記單克隆抗體，同時(shí)加注100 μl 抗凝循環(huán)靜脈血混勻并標(biāo)記30 min，并加入固定劑30 μl 固定5～10 min，隨后加紅細(xì)胞溶解液1 ml 溶解紅細(xì)胞10～20 min，最后加磷酸鹽緩沖液后用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞并進(jìn)行分檢。

1.4.3 循環(huán)血游離EBV-DNA 檢測(cè) EBV 感染相關(guān)性肝損傷患者EBV-DNA 檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供，采用Icyclerq qRT-PCR 儀。

1.4.4 肝功能檢測(cè) 采用ADVIA 2400 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能，HBV 感染血清標(biāo)志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，嚴(yán)格按說明書操作，其他病毒感染標(biāo)志物采用酶聯(lián)法檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，其中方差分析兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)性分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV 感染分布及構(gòu)成比

56 例EBV 病毒感染者中，單純EBV 感染組36 例 （64.29%），EBV 合并感染組20 例（35.71%），其中合并HAV 感染2 例（3.57%），合并HBV 感染8 例（14.29%），合并HCV 感染1 例（1.79%），合并CBV感染2 例（3.57%），合并VZV 感染3 例（5.36%），合并HBV、VZV 感染4 例（7.14%）。

2.2 各組肝功能情況

各組肝功能指標(biāo)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（P＜0.05）；單純EBV 感染組與EBV 合并感染組的肝功能指標(biāo)均較健康對(duì)照組升高（P＜0.05），EBV 合并感染組肝損傷程度較單純EBV 感染組重（P＜ 0.05）。見表1。

2.3 單純EBV 感染組與EBV 合并感染組治療前后T 淋巴細(xì)胞亞群的變化情況

治療前各組T 淋巴細(xì)胞亞群水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；單純EBV 感染組、EBV 合并感染組的CD3+T、CD8+T 水平高于健康對(duì)照組，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于健康對(duì)照組（P＜ 0.05）；EBV 合并感染組CD3+T、CD8+T 高于單純EBV 感染組，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于單純EBV 感染組 （P＜0.05）；治療后單純EBV 感染組CD3+T、CD8+T 水平較治療前下降，CD4+T 水平較治療前上升（P＜0.05）；治療后EBV 合并感染組CD3+T、CD8+T 水平較治療前下降，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平較治療前上升（P＜ 0.05），治療后單純EBV 感染組與EBV 合并感染組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EBV 合并 感染組CD3+T、CD4+T、CD8+T 水平高于EBV 單純感染 組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組肝功能指標(biāo)比較 （±s）

表1 各組肝功能指標(biāo)比較 （±s）

注：①與健康對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與單純EBV 感染組比較，P ＜0.05。

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表2 各組T 淋巴細(xì)胞亞群變化情況 （±s）

表2 各組T 淋巴細(xì)胞亞群變化情況 （±s）

注：①與健康對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與治療前比較，P ＜0.05；③與同列單純EBV 感染組比較，P ＜0.05。

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2.4 單純EBV 感染組治療前后EBV-DNA 載量與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

單純EBV 感染組治療前后CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T 水平 與EBV-DNA載量無相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

2.5 EBV 合并感染組治療前后EBV-DNA 載量與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

EBV 合并感染組治療前后CD3+T，CD4+T，CD8+T，CD4+/CD8+T 水平與EBV-DNA 載量間無相關(guān)性（P＞0.05）。見表4。

表3 單純EBV 組治療前后EBV-DNA 載量與 T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

表4 EBV 合并感染組治療前后EBV-DNA 載量與 T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

3 討論

病毒、藥物、酒精等均可導(dǎo)致肝組織損傷，病毒感染是導(dǎo)致肝損傷最為常見的原因之一。除HBV、HCV 等嗜肝細(xì)胞病毒感染所致肝損傷外，目前的非嗜肝病毒如EBV 感染所致肝損傷的發(fā)生率也越來越高。EBV 是一種嗜淋巴細(xì)胞的DNA 病毒，屬于皰疹病毒γ 亞科[4]，其通過侵犯B 淋巴細(xì)胞來發(fā)揮致病作用，因其表面存在EBV 受體而致B 細(xì)胞抗原性改變，活化T 淋巴細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞（EBVCTL），從而直接破壞攜帶EBV 的靶細(xì)胞（主要為B淋巴細(xì)胞）。EBV感染可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)，多器官損傷，其中肝臟是最常見的器官損害[5]。本組56 例EBV 合并感染中，合并HBV 感染最為多見，這與劉雅等研究報(bào)道一致[6]，該文獻(xiàn)指出，各種合并型病毒性肝炎患者中HBV 重疊EBV 感染最為常見，這是由于HBV 感染者的人群基數(shù)大，同時(shí)慢性乙性肝炎患者體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞免疫調(diào)控功能低下，病程中易重疊感染EBV[7]。本研究結(jié)果表明，EBV 合并感染組肝損傷程度較單純EBV 感染組重，這與蔡尚原等[8]報(bào)道相一致。可見EBV 合并其他病毒感染的患者肝功損害更重，且與單純EBV 感染患者相比，合并EBV 感染可加重肝臟損害，更易進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化、肝癌[6]。EBV 感染所致肝損害的病理機(jī)制尚不完全清楚，EBV 本身不具備損害肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，且損害程度與EBV 含量并無相關(guān)性，而肝細(xì)胞損傷的病理機(jī)制是因肝小葉、門管區(qū)單核淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（多為CD3+T、CD8+T 淋巴細(xì)胞），進(jìn)而造成肝實(shí)質(zhì)點(diǎn)狀壞死伴膽汁淤積[9]。本研究結(jié)果表明，治療前單純EBV 感染組，EBV 合并感染組的CD3+T、CD8+T 細(xì)胞亞群水平高于健康對(duì)照組，CD4+T、CD4+/CD8+T 水平低于健康對(duì)照組，EBV 合并感染組CD3+T、CD8+T 高于EBV 單純感染組，CD3+T、CD4+/CD8+T 水平低于EBV 單純感染組，這與崔強(qiáng)華等[10]報(bào)道結(jié)果一致。作者認(rèn)為，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是：CD3+是所有T 細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD4+是輔助性T 細(xì)胞（Th）的表面標(biāo)志，具有輔助細(xì)胞免疫與體液免疫的作用，CD4+T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量與頻率上調(diào)，可誘發(fā)免疫功能亢進(jìn)，CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量與頻率的下調(diào)可表示免疫輔助功能降低，CD8+則是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（Tc）的表面標(biāo)志，可直接殺傷靶細(xì)胞或誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，當(dāng)CD8+T 淋巴細(xì)胞受到刺激后進(jìn)行增殖，導(dǎo)致異性淋巴細(xì)胞比例增加[11]。EBV主要潛伏在B 淋巴細(xì)胞中，病毒增殖與高表達(dá)時(shí)細(xì)胞表面可表達(dá)多種抗原，并經(jīng)抗原提呈細(xì)胞提呈后激CD8+T 淋巴細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞毒效應(yīng)殺傷受到感染的B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致CD4+T 淋巴細(xì)胞大量消耗，外周血中CD4+T 細(xì)胞數(shù)量下降，患者出現(xiàn)CD4+/CD8+T 下降甚至倒置。CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞比值反應(yīng)機(jī)體的免疫狀況，其數(shù)量與頻率下調(diào)與免疫系統(tǒng)損傷的程度相關(guān)。本研究中合并感染組患者CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞表達(dá)率高于單純感染組，合并感染組患者CD4+T 淋巴細(xì)胞的表達(dá)率和CD4+/CD8+比值均低于單純感染組，這提示合并感染組T 淋巴細(xì)胞亞群紊亂程度更高，與陳靜[12]等研究結(jié)果相似。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，作者推測(cè)，可能是合并感染組肝功能損害更為嚴(yán)重，患者T淋巴細(xì)胞激活程度更高，導(dǎo)致CD4+與CD8+T 淋巴細(xì)胞比例降低，產(chǎn)生大量促炎因子，使免疫損傷程度更重。本研究結(jié)果表明，治療后CD3+T、CD8+T 較治療前下調(diào)明顯，CD4+T、EBV 合并感染組的CD4+/CD8+T上調(diào)，CD3+T、CD4+T、CD8+T水平高于EBV單純感染組，作者分析認(rèn)為，EBV 感染后的肝損傷常伴有Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，表現(xiàn)為Th1 型細(xì)胞因子功能障礙，Th2型細(xì)胞因子功能加強(qiáng)，導(dǎo)致其免疫功能降低，促進(jìn)病情進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，兩組治療前后，CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+T 水平與EBV-DNA 載量無相關(guān)性，這與朱嬋虹等[13]報(bào)道結(jié)果不一致，朱嬋紅等認(rèn)為：EBV-DNA 水平主要是反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制及感染情況，EBV-DNA 水平與是否合并其他病毒感染以及病情的嚴(yán)重程度正相關(guān)，臨床可以根據(jù)EBV-DNA 載量來判斷病情嚴(yán)重程度[13]。筆者認(rèn)為，EBV 病毒性肝炎的發(fā)生主要是T 淋巴亞群數(shù)量及頻率紊亂導(dǎo)致免疫功能失衡，而CD3+、CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及所釋放的致/抑炎因子失衡導(dǎo)致對(duì)肝細(xì)胞的免疫損傷，EBV 只是導(dǎo)致肝損傷中免疫反應(yīng)發(fā)生的啟動(dòng)因子，與EBV-DNA 載量無關(guān)。張慧等[5]對(duì)EBV 感染后肝功能正常組和異常組患者的研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者外周血中EBV-DNA載量無差異，而肝功能異常組CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+T 下降更明顯，表明EB 病毒性肝炎的發(fā)生與病毒載量無直接相關(guān)性。

筆者分析認(rèn)為，對(duì)EBV 病毒感染所致病毒性肝炎，其肝損程度可能與機(jī)體是否合并其他病毒感染和機(jī)體免疫狀況有關(guān)。EBV 肝炎也可能與EBV 病毒作為抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，形成免疫復(fù)合物，激活免疫反應(yīng)的強(qiáng)烈程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，多病毒重疊感染所致肝損傷明顯，病情較重，病程長(zhǎng)，這一點(diǎn)需引起重視[14]。本研究不足之處在于，由于是回顧性分析，未進(jìn)行出院的隨訪與相關(guān)指標(biāo)的跟蹤，特別是T 淋巴細(xì)胞及主要細(xì)胞因子水平與EBV-DNA載量間關(guān)系的跟蹤，有待進(jìn)一步研究。加之，本研究樣本偏少，研究對(duì)象僅為一個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)而非多中心研究，數(shù)據(jù)存在偏差的局限性。但仍期望通過本研究加深臨床醫(yī)師對(duì)EBV 病毒感染的重視，患者在出現(xiàn)肝損傷時(shí)，不僅僅是嗜肝病毒感染可以，也要重視非嗜肝病毒感染及其他原因所致。