EGFR靶向性MRI探針的制備及其與NSCC細(xì)胞靶向結(jié)合的研究*

劉成，李爍，張全明

（深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院 耳鼻喉科，廣東 深圳 518000）

鼻咽部鱗狀細(xì)胞癌（nasopharyngeal squamous cell carcinoma, NSCC）早期診斷困難，大多數(shù)診斷時(shí)已到晚期，錯(cuò)過手術(shù)最佳時(shí)機(jī)，患者的5年病死率較高，接近30%[1-2]。負(fù)載顯影劑、靶向因子和化療藥物的多功能分子影像探針是腫瘤治療研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，目前關(guān)于NSCC靶向顯影與治療多功能載體的研究較少[3-4]。本研究擬利用NSCC 表面表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）作為靶受體，構(gòu)建EGFR靶向性的MRI 探針，從體外細(xì)胞水平探討探針與NSCC 細(xì)胞靶向結(jié)合，為NSCC 早期診治提供思路和技術(shù)參考[5-6]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料與試劑

NSCC 和正常鼻咽細(xì)胞系由中南大學(xué)腫瘤研究所曹亞教授提供，超小型超順磁性氧化鐵（USPIO）[TANBead ? USPIO-101（臺(tái)灣先進(jìn)納米科技股份有限公司）核心為四氧化三鐵Fe3O4納米顆粒（Fe 濃度為 10 mg/ml），大小為6～10 nm，pH 值為（3.8±0.5）]，阿霉素（北京百奧萊博科技有限公司，HPLC ≥ 99.0%），西妥昔單抗（Cetuximab, CET，德國(guó)默克里昂制藥公司，規(guī)格100 mg ∶50 ml），甲醇分析純（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），碳化二亞胺鹽酸鹽EDC·HCl（上海品純?cè)噭┯邢薰荆?，明膠和核固紅染料（武漢博士德公司），標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液（GBW08616，1 000 μg/ml）（北京國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心），亞鐵氰化鉀分析純（天津市化學(xué)試劑三廠），胰酶、EDTA（美國(guó)Amresco 公司）。

1.2 主要設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），免疫熒光顯微鏡（同濟(jì)醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室），磁性分離器（臺(tái)灣先進(jìn)納米科技股份有限公司），4.7 T/30 cm 小動(dòng)物磁共振成像儀（德國(guó)Bruker Biospec 公司），普通細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)科俊儀器有限公司），JP-C50 型超聲波振蕩儀（廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司），JI80-2 型臺(tái)式離心機(jī)（武漢市首義醫(yī)療器械廠），HPIAS21000 型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)（武漢華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理教研室）。

1.3 方法

1.3.1 EGFR 靶向性MRI 探針的制備 將萘、鉀和丙烯醇溶解于四氫呋喃溶液，然后加入環(huán)氧乙烷及正己烷，利用陰離子開環(huán)聚合反應(yīng)合成一端為烯丙基另一端為羥基的聚乙二醇（Allyl-PEG-OH），通過烯丙基聚乙二醇的羥基端引發(fā)己內(nèi)酯開環(huán)聚合為烯丙基聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物（Allyl-PEG-PCl），利用烯丙基和2-氨基乙基硫醇鹽酸鹽的水相加成將烯丙基轉(zhuǎn)化為氨基，得到α-氨基聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物（NH2-PEGPCl），用葉酸修飾得到葉酸功能化的聚乙二醇聚己內(nèi)酯共聚物（Fa-PEG-PCl）[7]。合成疏水型Fe3O4納米粒子（SPION），將疏水型Fe3O4納米粒子表面改性，制備親水 型Fe3O4納米粒子（WSPIO），加入阿霉素（2mg/ml）376μl 混勻，后加入7.52mg EDC·HCl，然后采用溶劑揮發(fā)法制備負(fù)載超順磁性氧化鐵（SPIO）的聚合物膠束，得到表面親水、內(nèi)部疏水的EGFR 靶向性MRI 探針。

1.3.2 EGFR 靶向性MRI 探針理化特性的分析 探針的表征包括：粒徑、SPIO 和阿霉素（Doxorubicin, DOX）負(fù)載率、弛豫率。應(yīng)用透射電子顯微鏡（trans-mission electron microscope, TEM）測(cè)量探針的粒徑，采用原子吸收法測(cè)定SPIO 的含量，將已知重量的SPIO 分散到1 mol/L HCl 溶液中，使SPIO 分解為鐵離子并溶解在溶液中，根據(jù)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定280 nm處的吸收 得到DOX 的負(fù)載，測(cè)定248.3 nm 處的吸收，計(jì)算出鐵含量，用氧化鐵的質(zhì)量除以膠束的總質(zhì)量，得到SPIO 的負(fù)載率。通過MR 掃描儀行常規(guī)T2和T2maping 序列成像，掃描參數(shù)設(shè)置：回波時(shí)間分別取8.50、17.00、25.50、34.00、42.50、51.00、59.50 及68.00 ms，重復(fù)時(shí)間1 055 ms，視野10 cm×10 cm，層厚與層間距均為5 mm，矩陣256×256。觀察T2信號(hào)強(qiáng)度在探針溶液不同濃度（0、0.10、0.30、0.60、0.90、1.80 nmol/L）下的改變情況，獲得1/T2值，計(jì)算弛豫率。

1.3.3 NSCC 的培養(yǎng) 在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕 度下，采用RPMI 1640 培養(yǎng)液[含青霉素鈉（100u/ml）、鏈霉素（100u/ml）及小牛血清（100μg/m1）]進(jìn)行NSCC 和正常鼻咽細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3.4 普魯士藍(lán)染色 將SPIO 濃度分別為5、10、20、40 和80μg/ml 的EGFR 靶向性MRI 探針分別與NSCC 細(xì)胞及正常鼻咽細(xì)胞（細(xì)胞計(jì)數(shù)5×105個(gè)）在RPMI 1640 培養(yǎng)液中共孵育1h，之后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，用4%戊二醛固定10min，采用普魯士藍(lán)反應(yīng)液孵育30min，蒸餾水洗3 次，伊紅（0.5%）復(fù)染3min，顯微鏡下觀察Fe 染色情況[8]。

1.3.5 間接免疫熒光檢測(cè) 將等量NSCC 細(xì)胞接種在24 孔板中，并培養(yǎng)1d。當(dāng)NSCC 細(xì)胞鋪滿玻片時(shí)，采用冰甲醇進(jìn)行固定，10min 后采用PBS 洗玻片3 次，正常兔血清室溫封閉。40min 后，向各玻片分別加入EGFR 靶向性MRI 探針、西妥昔單抗及PBS。置入4℃濕盒1d。次日采用PBS 洗玻片3 次，加入含有FITC標(biāo)記的兔抗人IgG（避光），室溫孵育。采用Hoechst 33258 避光染色，采用PBS 洗玻片3 次，脫水、封片、熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 細(xì)胞的MRI 腫瘤磁敏感成像 在RPMI 1640培養(yǎng)液中加入EGFR 靶向性MRI 探針（SPIO 分別為0、5、10、20、40 和80 μg/ml）分 別與NSCC 細(xì)胞及正常鼻咽細(xì)胞孵育1 h，消化、洗滌、重懸細(xì)胞，置于1.5ml Ependoff 管中采用MRI 掃描[9]。采用Philips Intera 3T MRI 系統(tǒng)，環(huán)形表面線圈（C3 線圈）行軸面及冠狀面掃描，T2WI 采用快速自旋回波（FSE）系列，TE 100 ms，TR 1 600 ms，層厚1.5 mm，矩陣384× 512，4 次激勵(lì)。選擇相似的感興趣區(qū)測(cè)量6個(gè)信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算信號(hào)變化率（△SI），△SI=[（SIL-SIU）/SIU]×100%，SIL 為EGFR 靶向性MRI 探針與細(xì)胞共孵育后的信號(hào)強(qiáng)度，SIU 為細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR 靶向性MRI 探針的理化特性

EGFR 靶向性MRI 探針的粒徑為（77.0±1.5）nm，SPIO 負(fù)載率為（306.0±4.9）μg/ml，DOX 負(fù)載率為（103.3±3.1）μg/ml，弛豫率為（110.4±2.9），提示EGFR 靶向性MRI 探針制備成功。見圖1、2。

2.2 普魯士藍(lán)染色結(jié)果

EGFR 靶向性MRI 探針與NSCC 細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞內(nèi)可見不同量的藍(lán)色Fe 顆粒，隨著SPIO 濃度的升高而增多；EGFR 靶向性MRI 探針與正常鼻咽細(xì)胞共孵育，細(xì)胞內(nèi)未見明顯Fe 顆粒存在。見圖3。

2.3 EGFR 靶向性MRI 探針對(duì)NSCC 細(xì)胞的免疫結(jié)合活性

西妥昔單抗（陽(yáng)性對(duì)照）在NSCC 細(xì)胞膜有強(qiáng)烈的綠色熒光表達(dá)，陰性對(duì)照呈現(xiàn)很微弱的綠色熒光表達(dá)，EGFR 靶向性MRI 探針與西妥昔單抗熒光強(qiáng)度相近。見圖4。

圖1 EGFR 靶向MRI 探針的TEM 圖 （×200）

圖2 馳豫曲線

圖3 NSCC 細(xì)胞內(nèi)可見不同量的藍(lán)色Fe 顆粒 （普魯士藍(lán)染色×200）

圖4 3 組NSCC 細(xì)胞內(nèi)不同的綠色熒光表達(dá) （Hoechst 33258 染色×200）

2.4 體外MRI

隨濃度0、5、10、20、40 和80 mg/ml 梯度升高，EGFR 靶向性MRI 探針T1信號(hào)基本無變化，EGFR 靶向性MRI 探針T2信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱，EGFR 靶向性MRI 探針在20、40 和80 mg/ml 3個(gè)濃度點(diǎn)比較，T2信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，其中80 mg/ml T2信號(hào)強(qiáng)度下降最顯著（見圖5）。EGFR 靶向性MRI 探針與NSCC 細(xì)胞共孵育后MRI 信號(hào)在T2WI 上有不同程度的減低（P＜ 0.05），SPIO 濃度越高M(jìn)RI 信號(hào)強(qiáng)度減弱越明顯（P＜ 0.05）。見表1。

圖5 體外MRI

表1 不同濃度SPIO 與NSCC 細(xì)胞孵育后在T2WI 上信號(hào)變化情況比較 （±s）

表1 不同濃度SPIO 與NSCC 細(xì)胞孵育后在T2WI 上信號(hào)變化情況比較 （±s）

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3 討論

NSCC 發(fā)病機(jī)制尚不明確，是臨床常見的耳鼻咽喉惡性腫瘤之一[10-12]。臨床上，放療是NSCC 治療的主要手段。研究表明，單純放療治療各期NSCC 的5年總生存率可達(dá)70%。為此，制定合理的放療靶區(qū)是提高NSCC 治愈率的關(guān)鍵因素。MRI 具有良好的軟組織對(duì)比性及空間分辨率，能較好地診斷NSCC，但常規(guī)的MRI 常用的造影劑釓（Gd-DTPA）未分布在特殊的靶向器官，只對(duì)T1信號(hào)增強(qiáng)，并未能顯示亞臨床病灶。USPIO 是一種粒徑小、具有超順磁性、敏感性高、毒性低和生物可降解的新型磁性納米生物材料，常用于惡性腫瘤的影像診斷中。相關(guān)研究表明，NSCC 的EGFR 表達(dá)水平≥85%[13]。EGFR 是一種已知分子量為170～180 kD 的糖蛋白單體，其與配基結(jié)合后，可提高絡(luò)氨酸激酶活性，從而吸引具有SH2 區(qū)域的信號(hào)分子，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞分裂、信號(hào)傳遞、DNA 復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄等一系列變化，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、黏附、侵襲及其轉(zhuǎn)移，進(jìn)而誘導(dǎo)形成腫瘤的作用[14]。因此，制備EGFR 靶向性MRI 探針對(duì)高表達(dá)EGFR 的NSCC 進(jìn)行MRI 免疫顯像理論上是可行的。

本研究自行制備EGFR 靶向性MRI 探針，觀察其對(duì)EGFR 表達(dá)陽(yáng)性的NSCC 細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用，即配體介導(dǎo)、位點(diǎn)特異性的納米復(fù)合物在腫瘤細(xì)胞中的聚集，探討靶向性。將不同濃度SPIO 的EGFR 靶向性MRI 探針與NSCC 細(xì)胞孵育，通過普魯士藍(lán)染色、間接免疫熒光和MRI 觀察NSCC 細(xì)胞對(duì)EGFR 靶向性MRI 探針的攝取情況，結(jié)果顯示，普魯士藍(lán)染色證實(shí)EGFR 靶向性MRI 探針對(duì)NSCC 細(xì)胞的靶向攝取依賴于SPIO 濃度，西妥昔單抗（陽(yáng)性對(duì)照）在NSCC細(xì)胞膜有強(qiáng)烈的綠色熒光表達(dá)，陰性對(duì)照呈現(xiàn)很微弱的綠色熒光表達(dá)，提示陽(yáng)性對(duì)照NSCC 細(xì)胞膜EGFR高表達(dá)，陰性對(duì)照是非特異性結(jié)合導(dǎo)致；EGFR 靶向性MRI 探針細(xì)胞膜有強(qiáng)烈的綠色熒光表達(dá)，EGFR 靶向性MRI 探針組與西妥昔單抗熒光強(qiáng)度相近，說明EGFR 靶向性MRI 探針有良好的免疫活性和結(jié)合活性，EGFR 靶向性MRI 探針可特異性結(jié)合進(jìn)入NSCC細(xì)胞內(nèi)，從而降低MRI T2信號(hào)強(qiáng)度。

綜上所述，EGFR 靶向性MRI 探針的粒徑小，可降低MRI 的T2信號(hào)強(qiáng)度，具有高度的靶向性。EGFR靶向性MRI 探針為NSCC 的早期準(zhǔn)確診斷和治療提供新的思路和技術(shù)，其NSCC 體內(nèi)示蹤有利于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病灶的早期檢出，可在準(zhǔn)確診斷的同時(shí)進(jìn)行聯(lián)合化療，值得推廣。