渦蟲神經(jīng)再生相關(guān)基因及其調(diào)控通路

劉榮華，石曉宇，徐 風，趙東芹

(山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東省動物抗性生物學(xué)重點實驗室，山東 濟南 250014)

神經(jīng)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)動物生理功能、控制動物行為上發(fā)揮著重要作用，因此解析動物生命活動過程和神經(jīng)系統(tǒng)的再生是一個極具魅力又富有挑戰(zhàn)性的問題。渦蟲隸屬于系統(tǒng)發(fā)育過程中最早具有由神經(jīng)元組成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)和兩側(cè)對稱體制的扁形動物門[1-2]。組成其頭部神經(jīng)節(jié)——“腦”的神經(jīng)元較其他高等無脊椎動物與脊椎動物具有更高的相似性[3-4]，加上其獨特的再生特性[5]，已被用作研究神經(jīng)、器官再生機制的模式生物[6-7]。目前，渦蟲主要的模式種有地中海渦蟲(Schmidteamediterranea)、日本三角渦蟲(Dugesiajaponica)和Girardiatigrina三種[8]。國內(nèi)對渦蟲神經(jīng)再生的研究起步較晚，可供參考的文獻較少，最近的一篇綜述是胡國安等[9]在2014年發(fā)表的。國外對渦蟲神經(jīng)再生的研究較深入，已經(jīng)從分子水平上對渦蟲神經(jīng)再生的機制進行了探究，Ross等人[10]在2017年發(fā)表的綜述中，總結(jié)了早期對渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)的解剖和功能的研究，并討論了目前對控制渦蟲神經(jīng)發(fā)生分子機制的認識。本文基于三種渦蟲神經(jīng)再生相關(guān)文獻，著重對渦蟲神經(jīng)再生過程所涉及的基因及神經(jīng)再生重要信號通路等內(nèi)容進行論述，為探討渦蟲神經(jīng)再生的分子機制和研究高等動物如人類神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)相關(guān)疾病的治療等提供背景資料。

1 渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)

早期神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的染色方法主要包括Masson染色、H-E染色和Van Gieson染色，這三種方法均可清晰地顯示渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)[11]。隨著基于神經(jīng)特異性基因[12-13](如otd/otx相關(guān)基因)、神經(jīng)特異性基因產(chǎn)物[14-15](如突觸蛋白Ⅶ，乙酰膽堿受體)的原位雜交、抗原抗體組織學(xué)定位等技術(shù)對形態(tài)學(xué)分析的深入，學(xué)者不僅將渦蟲的腦與神經(jīng)索區(qū)分開來，還進一步將渦蟲的腦分為多個不同的分子和功能區(qū)域。綜合各種形態(tài)學(xué)研究結(jié)果，渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)的形狀是基本相同的，都由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)兩部分組成。CNS由神經(jīng)元胞體和神經(jīng)索構(gòu)成，主要包括前部的一對“大腦”(或稱為頭部神經(jīng)節(jié)，brain)、一對眼點(eyes)、兩個貫穿身體全長的縱向腹神經(jīng)索(ventral nerve cord，VNC)和連接左右的橫神經(jīng)(transverse commissures)。PNS由表皮下神經(jīng)叢、肌下神經(jīng)叢和胃胚層神經(jīng)叢組成，表皮下神經(jīng)叢是位于表皮和肌壁之間的稀疏網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。肌下神經(jīng)叢位于肌壁下面，是由神經(jīng)纖維束從交點向多個方向延伸形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，較表皮神經(jīng)叢更厚、更密集。胃胚層神經(jīng)叢的解剖學(xué)還不太清楚，認為是由圍繞腸的單根神經(jīng)纖維的構(gòu)成薄網(wǎng)[10]。

2 渦蟲神經(jīng)再生相關(guān)基因

渦蟲的神經(jīng)元較其他高等無脊椎動物與脊椎動物具有更高的相似性，因而從分子水平上研究其再生的機制可以為研究脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生提供依據(jù)。目前已發(fā)現(xiàn)20多個渦蟲神經(jīng)相關(guān)基因(表1)，有趣的是，其中一些基因與已知的相同功能基因缺乏序列相似性[16]，這些特異性基因的表達可以作為CNS神經(jīng)標記來闡明神經(jīng)再生的機制，有助于我們直接定義渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生中可能的功能域。

表1 表達于CNS的部分基因Tab.1 Some genes expressed within the planarian CNS

基因蛋白主要表達部位功能物種DjotxA[12]DjotxA protein腦中部建立和維持大腦離散區(qū)域D. japonicaDjotxB[12]DjotxB protein腦中部建立和維持大腦離散區(qū)域D. japonicaDjotp[12]腦前側(cè)枝建立和維持大腦離散區(qū)域D. japonica944-HH[13]腦神經(jīng)節(jié);腹神經(jīng)索D. japonica1008-HH[13,17]腦側(cè)枝D. japonica1020-HH[13]1020HH腦神經(jīng)節(jié)D. japonica721-HH[13]腦神經(jīng)節(jié);其他頭部細胞D. japonicaEye53[13]Eye53腦神經(jīng)節(jié);視覺細胞;腹神經(jīng)索周圍細胞D. japonica4307HH[17-18]腦神經(jīng)節(jié);腹神經(jīng)索D. japonicaDjCAM[17,19]Cell adhesion molecule腦神經(jīng)節(jié);腹神經(jīng)索參與軸突的形成D. japonicaDjDSCAM[17,19]Down syndrome cell adhesion molecule腦神經(jīng)節(jié)參與神經(jīng)元細胞遷移,軸突生長、成束狀和投射D. japonicaDjCHC[17,20]Clathrin heavy chain神經(jīng)突起組成的海綿狀區(qū)域參與頭部的再生與維持D. japonicaDjeya[17,21]Eyes absent homolog, EC 3.1.3.48光感受器,腦神經(jīng)節(jié)內(nèi)側(cè)和外側(cè)參與眼部細胞再生D. japonicaDjsix-1[21]Djsix-1光感受器參與眼部細胞再生D. japonicaDjFoxG[17,22]Winged helix/forkhead tran-scription factor腦神經(jīng)節(jié)D. japonicaDjFoxD[22]Winged helix/forkhead tran-scription factor頭前部正中線部分D. japonicaDjPC2[17,22]腦神經(jīng)節(jié);腹神經(jīng)索D. japonicaDjnlg[17,23]Noggin like protein腦側(cè)枝背腹軸形成D. japonicaDjPsa[24]M1 zinc metallopeptidase family腦神經(jīng)節(jié);腹神經(jīng)索參與腦原基分化和腦的形成D. japonica

表1(續(xù))

2.1 細胞調(diào)控基因

渦蟲-網(wǎng)格蛋白重鏈基因(planarianclathrinheavychaingene, DjCHC)對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常再生和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是必需的。體外和體內(nèi)分析結(jié)果顯示DjCHCRNA干擾(RNAinterference,RNAi)會抑制神經(jīng)元存活、神經(jīng)突起生長，同時相關(guān)實驗結(jié)果說明DjCHCRNAi引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)萎縮是由于對分化神經(jīng)元細胞的作用而不是對干細胞的影響[20]。

noggin樣基因(noggin-likegene, Djnlg)參與渦蟲再生期間背腹軸(dorsoventral,DV)信號系統(tǒng)的建立，通過與BMP相互作用刺激胚泡形成和DV圖案化，這個過程也發(fā)生在脊椎動物胚胎發(fā)生過程中[23]。

渦蟲截頭后，腦再生的關(guān)鍵事件包括干細胞新生細胞增殖、腦原基形成以及腦細胞分化[40]。DjPsa沉默會抑制分化為新腦的初始神經(jīng)元簇的形成，DjPsaRNAi處理的渦蟲的再生腦區(qū)較正常再生腦薄，且10d時腦神經(jīng)間U形仍未閉合[24]。這些結(jié)果表明DjPsa參與再生早期腦原基的形成，并與腦細胞的分化以及正常腦的形成有關(guān)。nou-darake(ndk)對頭部的再生也有重要作用[38]。注射ndkdsRNA的再生渦蟲，早期的再生階段是正常的，分化產(chǎn)生新的腦樣結(jié)構(gòu)胚泡；但在再生的第4～5d，腦樣結(jié)構(gòu)胚泡在形成腦部位之外分化，并且隨著再生的進行，異位腦逐漸擴大進入更多的后部區(qū)域。研究還發(fā)現(xiàn)注射ndkdsRNA后，在完整、非再生的渦蟲中也觀察到異位腦組織的分化。ndk可以限制腦誘導(dǎo)因子從渦蟲頭部到身體其他部位的擴散，ndk功能的喪失使限制腦誘導(dǎo)因子擴散到后部區(qū)域，從而觸發(fā)異位腦的形成。

復(fù)制因子C(replicationfactorC,RFC)在DNA損傷反應(yīng)和DNA修復(fù)過程中通過協(xié)助DNA精確復(fù)制確保了生物過程中基因組的穩(wěn)定性。Rfc2是RFC的亞單位之一，在渦蟲中由Djrfc2表達。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法對完整和再生渦蟲中差異表達蛋白鑒別和分析，發(fā)現(xiàn)Rfc2的分布傾向于受傷部位。對Djrfc2進行RNAi處理，發(fā)現(xiàn)分裂細胞的數(shù)量增加，渦蟲新胚葉中標記基因的的表達水平升高，進而導(dǎo)致過度增生[25]。

Dj-Rho激酶2基因(Dj-Rhoassociatedproteinkinase2, DjRock2)存在于CNS中且特異表達，尤其是頭部神經(jīng)節(jié)處，主要作用是有助于視神經(jīng)的形成及維持。推測可能是通過調(diào)節(jié)Rock經(jīng)典信號通路，進一步調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain,MLC)控制多功能成體干細胞增殖和分化，達到調(diào)節(jié)再生的目的[26]。

糖原合酶激酶-3基因(glycogenaseki-nase-3gene, GSK3)產(chǎn)物GSK3是已知參與神經(jīng)元組織的幾個信號級聯(lián)中的關(guān)鍵元件。用GSK3抑制劑1-azaken-paullone處理渦蟲后發(fā)現(xiàn)這些動物中的頭部神經(jīng)節(jié)比正常組小，并且中間連接斷開，視覺軸突基因異位表達，但咽部能再生正常，說明GSK3基因的主要功能是維持腦部神經(jīng)系統(tǒng)的正常分化和形態(tài)發(fā)生[29]。

2.2 神經(jīng)再生軸突導(dǎo)向因子

軸突導(dǎo)向即為在神經(jīng)發(fā)育過程中，神經(jīng)元發(fā)出軸突并在正確位置形成突觸，保守的軸突導(dǎo)向機制對于動物早期發(fā)育過程中神經(jīng)系統(tǒng)的適當布局是必需的[36]。在中樞神經(jīng)再生過程中，受損的軸突需要向其原始目標突起，從而重建正確的功能連接。

使用RNA干擾的功能分析表明，DjCAM部分參與軸突形成，DjDSCAM在神經(jīng)元細胞遷移，軸突生長、成束狀和投射中起著至關(guān)重要的作用[19]。在沒有DjCAM或DjDSCAM表達的情況下，一些構(gòu)成腦側(cè)枝的神經(jīng)元未能產(chǎn)生軸突束，腦側(cè)枝數(shù)目明顯減少，投射也出現(xiàn)了嚴重的異常[19]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的軸突投射過程中，DjCHC可能也是需要的。DjCHC沉默不抑制視神經(jīng)元的分化，但是左、右視神經(jīng)元向相反視神經(jīng)元的投射和視神經(jīng)到大腦的連接被抑制[20]。

Smed-netR和Smed-roboA可能在建立頭部神經(jīng)節(jié)與VNC之間的正確關(guān)系中起重要作用[35-36]。在實施Smed-netRRNAi之后，再生渦蟲大腦和VNC之間的關(guān)聯(lián)有些丟失，新的大腦和VNCs的模式被破壞：VNCs在腦下形成了紊亂的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，新的頭部神經(jīng)節(jié)更短、更寬并延伸到VNCs更旁側(cè)[35]。此外，Smed-netR還在光感受器軸突靶向投射到大腦視覺中樞中起著重要作用[36]。在Smed-roboARNAi之后，VNCs和新形成的頭部神經(jīng)節(jié)沒有正確連接，并且在前部再生過程中，觀察到額外的咽的發(fā)育和在新再生的頭部區(qū)域與已存在的咽之間的一個背部外露。Smed-roboA沉默還導(dǎo)致連接兩個頭神經(jīng)節(jié)的前連合明顯變少，并且在某些情況下前連合完全喪失[36]。

2.3 三種渦蟲神經(jīng)再生過程中相關(guān)基因比較

S.mediterranea中的Smed-wnt5與G.tigrina中的Gtwnt-5編碼同源蛋白，Smed-wnt5限制和定義再生過程中神經(jīng)元組織的位置；在再生5d時，在靠近傷口的神經(jīng)索中發(fā)現(xiàn)Gtwnt-5表達增加，推測這可能與該區(qū)域重塑到新腦神經(jīng)節(jié)的后部有關(guān)[30,33]。D.japonica中的DjwntA與S.mediterranea中的Smed-wntA不僅編碼同源蛋白，而且沉默這兩個基因在渦蟲再生中導(dǎo)致相似的結(jié)果，即再生出的新腦與正常腦相比長度加長以及視覺中心的異常[28,33]。Pax6A和Pax6B在D.japonica和G.tigrina的再生過程中都有表達，在再生3-6 d后，可以在囊胚的弓形結(jié)構(gòu)中檢測到Pax6A的表達，可能是由于這兩種動物的神經(jīng)節(jié)形態(tài)不同，這種弓形表達模式在G.tigrina中更清楚[41]。

3 渦蟲神經(jīng)再生重要信號通路

鑒定啟動和指導(dǎo)過程的信號可有助于更好地了解再生過程。

3.1 Wnt信號通路

Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin信號通路，非經(jīng)典Wnt信號通路主要包括Wnt-Ca2+信號通路、平面極細胞通路及調(diào)節(jié)紡錘體的方向和非對稱細胞分裂的胞內(nèi)通路[42]。渦蟲Wnt/β-catenin信號在渦蟲再生過程中，對再生極性的決定起著重要的作用[8]。wnt基因?qū)u蟲的前后軸、中側(cè)軸的建立、腦部以及神經(jīng)系統(tǒng)的形成等有關(guān)，其中，wnt5和wnt11-6與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，Smed-wnt5在中側(cè)軸的建立中起作用，可以抑制神經(jīng)系統(tǒng)和中間組織向兩側(cè)的擴展，RNAi該基因的渦蟲出現(xiàn)偏離的頭部神經(jīng)節(jié)以及膨大的再生神經(jīng)組織，wnt5家族與非經(jīng)典Wnt信號途徑有關(guān)，不依賴于β-catenin[8]。Smed-wnt11-6在腦前部的A-P軸的形成包括腹索神經(jīng)索的形成中起作用，但不影響腦部中側(cè)軸的形成[8]。

3.2 BMP信號通路

BMP信號傳導(dǎo)作為一種典型信號通路，參與了眾多發(fā)育事件。其中，有三種基因參與了渦蟲左右不對稱形狀的再生，分別是BMP1/Tolloid-like基因(smedolloid-1)、SMAD4-like基因(smedsmad4-1)和BMP2/4/DPP-like基因(smedbmp4-1)[43]。smedolloid-1在背部背側(cè)細胞中表達，smedbmp4-1在背中線細胞中表達，研究顯示，缺乏左右對稱的受傷渦蟲，在早期再生中會通過調(diào)節(jié)BMP活性來形成新的中線，如果SMEDBMP4-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受擾,手術(shù)產(chǎn)生的缺乏左右對稱性的渦蟲片段不能正常再生[43]。Smed-BMPRNAi處理的渦蟲再生了額外的光感受器，并且，視覺軸突的在前部異位投射，腦的腹面出現(xiàn)向背部的膨大[44]。

3.3 Hedgehog信號通路

在脊椎動物中，Hedgehog(HH)信號介導(dǎo)的許多發(fā)育事件，除了在脊髓腹側(cè)模式中作為形態(tài)發(fā)生因子的作用，還包括少突膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生及其在控制神經(jīng)祖細胞增殖中的促分裂作用[45]。Patched(ptc)是HH信號靶細胞膜上一種受體，對HH信號的表達起負調(diào)控的作用[46]。這種受體是日本三角渦蟲頭部再生所必需的[47]。此外，在渦蟲再生過程中，HH信號通過調(diào)節(jié)Wnt家族基因的轉(zhuǎn)錄，來建立的前后(anterior-posterior,AP)極性從而進一步指導(dǎo)頭部或者尾部的再生[47]。

4 總結(jié)與展望

扁形動物是左右對稱、具有真正突觸和腦的動物，渦蟲作為扁形動物中自由生活種類，因其再生能力強、再生周期短、易飼養(yǎng)等特性在研究神經(jīng)、器官再生及其機制中占有獨特的地位。目前關(guān)于渦蟲神經(jīng)的研究多限于正常生境下、成體渦蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，異常生境下、胚胎發(fā)育及再生過程中這些再生相關(guān)基因是如何對神經(jīng)系統(tǒng)的重建進行時空調(diào)控的？受損或受傷神經(jīng)是如何重新建立正確的突觸聯(lián)系并整合到原有神經(jīng)環(huán)路中的？調(diào)控通路又是如何呢？這些問題均還尚不清楚。此外，扁形動物很多典型的神經(jīng)再生調(diào)控因子在高等生物中高度保守，所以了解渦蟲神經(jīng)再生過程所涉及的基因分布有助于選擇CNS和PNS特異性基因進行神經(jīng)標記，有助于探討渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生中可能的功能域，探究渦蟲神經(jīng)再生的分子機制，為研究高等動物包括人類神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)相關(guān)疾病的治療等提供背景資料。