陸地棉SPL基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析①

鐘子達(dá)，鐘曉真，沈超

( 廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000)

鱗狀啟動子結(jié)合蛋白樣(SPL)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在綠色植物中廣泛存在[1]。SPL含有一個高度保守的SBP-box的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域[2]，SBP結(jié)構(gòu)域?qū)Ｒ蛔R別并結(jié)合一段以GTAC為核心元件的回文序列[3]，具有2個均含有8個保守的半胱氨酸(Cys)或組氨酸(His)殘基的獨(dú)立鋅指結(jié)構(gòu)[4]。

SPL轉(zhuǎn)錄因子影響植物的頂芽、花序發(fā)育以及開花時間[5]。SPL最初是從金魚草[6]中發(fā)現(xiàn)的，它能識別并結(jié)合到SQUAMOSA (SQ-UA)的啟動子上，進(jìn)而參與調(diào)控金魚草早期的花發(fā)育和開花過程[7]。研究發(fā)現(xiàn)，SPL對植物花和果實(shí)的發(fā)育、脅迫應(yīng)答、孢子形成、激素信號傳導(dǎo)以及植物階段轉(zhuǎn)變[8-17]等多種生理生化過程都有一定的調(diào)控作用，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。

棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是天然纖維的主要來源。耕地面積的日益減少加劇了糧棉爭地的矛盾，培育短季棉品種成為當(dāng)前一個重要育種目標(biāo)[18]。開花提前可以縮短生育期，因此研究SPL基因家族，對短季棉育種具有重要促進(jìn)作用。本研究利用生物信息學(xué)方法，對棉花主要栽培種陸地棉中SPL基因家族成員進(jìn)行鑒定及分析，從全基因組水平解析其基本理化性質(zhì)、基因數(shù)目、基因結(jié)構(gòu)與Motif變化、基因的進(jìn)化和染色體定位等方面，為進(jìn)一步探究SPL基因在棉花的成花轉(zhuǎn)變、花發(fā)育中的功能和短季棉育種研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 SPL基因的鑒定

在Cotton FGD數(shù)據(jù)庫(https://cottonfgd.org)中下載陸地棉(AD1, HAU)的基因組數(shù)據(jù)。在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載SPL蛋白的hmm文件，標(biāo)號為PF03110。使用 HMMER 3.0 軟件(http://hmmer.org/)和BLASTP 程序比對含有SBP蛋白結(jié)構(gòu)域的序列。之后，用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)和保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行比對驗(yàn)證。

1.2 陸地棉SPL基因家族成員的特性、基因結(jié)構(gòu)與染色體定位分析

利用ExPASy的在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)對陸地棉SPL基因家族成員的氨基酸長度、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。使用ProtComp9.0 (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomp-pl&group=programs&subgroup=proloc)預(yù)測其亞細(xì)胞定位。利用GSDS v2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析繪制其基因結(jié)構(gòu)圖。利用MEME (http://meme-suite.org/) 對SPL蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)量設(shè)置為10，其他參數(shù)為默認(rèn)值。利用NPSA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。利用TBtools v0.6731 (https://github.com/CJ-Chen/TBtools-Manual) 定位基因在染色體上的位置。

1.3 多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MEGA 7.0[19]軟件對獲得的SPL序列進(jìn)行多重序列比對?；诙嘈蛄斜葘Σ捎米畲笏迫环?gòu)建進(jìn)化樹，執(zhí)行參數(shù) Bootstrap 1000次重復(fù)，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值。

1.4 陸地棉SPL家族基因的表達(dá)模式分析

基于陸地棉RNA-seq數(shù)據(jù)[20]分析陸地棉SPL基因的表達(dá)模式，包括棉花的根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭和開花后5，10，15，20，25 d的纖維及0，1，3，10，20 d的胚珠等組織。

2 結(jié)果與分析

陸地棉SPL基因家族的生物信息學(xué)分析主要包括理化分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析等內(nèi)容。

2.1 SPL家族成員的鑒定和理化分析

最終在陸地棉中鑒定到30個SPL基因(表1)。在陸地棉中，基因的長度為1125～8132 bp，其中Ghir_D13G016090基因最短，為1125 bp，Ghir_A12G013050基因最長，為8132 bp。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)：陸地棉中SPL編碼氨基酸的數(shù)量為141 ～ 1081，Ghir_A10G002400的氨基酸數(shù)量最少，為141，Ghir_A01G009280和Ghir_D01G009680的氨基酸數(shù)量最多，為1081，平均為527.9；相對分子質(zhì)量介于16.11 ～ 119.59 kDa，等電點(diǎn)為5.25～9.88，亞細(xì)胞定位表明有6個基因定位到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(表1)。

表1 陸地棉中SPL特征

續(xù)表

2.2 SPL的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)發(fā)育分析表明：SPL基因家族可以分為6個亞群，同一分支的進(jìn)化程度相近，親緣性高，不同亞群中的基因數(shù)目不等(圖1)。

圖1 陸地棉SPL家族基因的進(jìn)化分析

2.3 SPL基因家族的結(jié)構(gòu)

陸地棉SPL基因家族成員結(jié)構(gòu)的外顯子數(shù)目為2 ～ 12個，其中Ghir_A10G010450的外顯子數(shù)目最多，為12個(圖2)，進(jìn)一步分析得到10種保守基序，命名為Motif1—Motif10，每個成員含有3～10個Motif(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，同一組內(nèi)具有相似的外顯子數(shù)目且具有相似的基因序列結(jié)構(gòu)。

圖2 陸地棉SPL的結(jié)構(gòu)分析 圖3 陸地棉SPL家族保守基序分析

2.4 SPL基因在染色體上的定位

SPL基因分布在陸地棉18條染色體上(圖4)。每條染色體上基因的分布數(shù)量不等，A亞基因組的A02、A03、A04、A07和A08以及 D亞基因組的D01、D02、D04和D08染色體上各有1個基因；A亞基因組的A10、A12、A13和D亞基因組的D10、D12、D13染色體上分別有2個基因；A亞基因組的A11染色體有3個基因(圖4)。

圖4 陸地棉SPL基因家族染色體定位

2.5 SPL的二級結(jié)構(gòu)分析

對陸地棉SPL蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析，如表1所示。發(fā)現(xiàn)SPL基因家族均含有α螺旋、β折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)原件。無規(guī)卷曲的占比最高(除基因Ghir_A01G005270，Ghir_A10G002400，Ghir_D10G003180外)，其次是α螺旋、延伸鏈和β折疊(表1)。

2.6 SPL基因的表達(dá)模式分析

通過對陸地棉SPL在棉花的根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭和開花后5，10，15，20，25 d的纖維及開花后 0，1，3，10，20 d的胚珠中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，分析發(fā)現(xiàn)Ghir_D08G004350、Ghir_A08G004140、Ghir_A12G013050、Ghir_D12G013270、Ghir_D01G009680、Ghir_A01G009280、Ghir_A11G011170、Ghir_D11G011120、Ghir_D10G017550這9個基因在組織中的表達(dá)量很高(圖5)，例如：Ghir_D08G004350在花瓣的表達(dá)最高，表明該基因可能參與調(diào)控花瓣的生長發(fā)育。有些基因的表達(dá)量非常低，例如：Ghir_A01G005270除了在根和柱頭表達(dá)量較高外，在其他組織的表達(dá)量很低，甚至不表達(dá)。

圖5 陸地棉SPL基因家族的組織表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

基因組測序技術(shù)的發(fā)展對基因組研究、轉(zhuǎn)錄因子的鑒定與表達(dá)分析起到了極大的促進(jìn)作用。SPL基因家族在許多物種中都得到了深入的研究，表明它們在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，并且不同物種的SPL數(shù)量也不同。

隨著棉花基因組測序的完成與更新，本研究在陸地棉中鑒定30個SPL基因并進(jìn)一步預(yù)測了其理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系。研究結(jié)果表明，陸地棉中SPL相對分子質(zhì)量為16.11 ～ 119.59 kDa，等電點(diǎn)介于5.25 ～ 9.88。二級結(jié)構(gòu)主要元件為無規(guī)則卷曲。聚類分析顯示，SPL基因可以分為6個亞組，同一分支的進(jìn)化程度相近，親緣性高。結(jié)合基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，同一組內(nèi)的SPL基因具有相似的外顯子、內(nèi)含子數(shù)目和保守基序，推測其結(jié)構(gòu)域進(jìn)化和基因的結(jié)構(gòu)多樣性相關(guān)?；虻娜旧w定位發(fā)現(xiàn)SPL基因并非出現(xiàn)在所有的染色體上。

進(jìn)一步分析SPL基因的組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在陸地棉中，Ghir_D08G004350基因可能參與調(diào)控花瓣的生長發(fā)育。Ghir_A01G005270基因可能與陸地棉的根和柱頭的生長發(fā)育有關(guān)。本研究全面分析了陸地棉SPL的性質(zhì)特征，表明其在棉花的發(fā)育過程中具有重要作用，可為SPL基因后續(xù)功能研究提供借鑒。