荷澤顆粒對脾虛大鼠血清胃泌素、D-木糖濃度、磷酸肌酸激酶的影響*

張 明 吳 晶 彭 真 崔榮華 張菁華 向希雄△

（1.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061）

脾虛證是脾系系統(tǒng)常見的證候類型，脾乃先天之本，影響一身正氣的盛衰，影響疾病的轉(zhuǎn)歸，對小兒的生長發(fā)育及免疫力尤為重要。荷澤顆粒是湖北省中醫(yī)院兒科用于治療小兒單純性肥胖的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)此方兼具有健脾作用，故本實(shí)驗(yàn)采用苦寒瀉下、勞倦過度及饑飽失常等復(fù)合因素制作脾虛模型，檢測荷澤顆粒對脾虛證大鼠的胃泌素（GAS）、D-木糖濃度及CK活性的影響，以期證實(shí)此療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康Wistar大鼠120只，體質(zhì)量（180±20）g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。使用許可證號：SYXK（鄂）2017-0095。

1.2 試藥和儀器 生大黃飲片（湖北天濟(jì)飲片有限公司）12 kg，入水浸泡30 min，取800 mL浸液煎煮，待水沸騰后，煎煮5 min，過濾、濃縮至濃度為200%的藥液。四君子湯：黨參、云茯苓、白術(shù)、炙甘草，按照質(zhì)量比3∶3∶3∶2組成（即黨參300 g，云茯苓300 g，白術(shù)300 g，炙甘草200 g）［1］，浸泡后，常規(guī)煎煮2次，用紗布過濾濾液，2次藥液混合后，濃縮至濃度為100%的藥液。荷澤顆粒：荷葉600 g，澤瀉540 g，薏苡仁540 g，蒼術(shù)540 g，決明子360 g，枳實(shí)180 g，山楂360 g，知母180 g。浸泡后，常規(guī)煎煮2次，用紗布過濾濾液，2次藥液混合后，濃縮至濃度為100%的藥液。鼠GAS酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物有限公司，E-ELR0472c）；D-木糖測定試劑盒（南京建成生物研究所）。CK活性由湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科中康園代為檢測，采用生化檢測方法。

1.3 分組與造模 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性觀察喂養(yǎng)5 d，然后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組20只、模型組100只。脾虛大鼠模型制備：采用苦寒瀉下、勞倦過度及飲食失節(jié)等復(fù)合因素復(fù)制脾虛模型［2］，除正常組外，模型組灌服生大黃煎劑4 mL/d，每日將大鼠放入水深50 cm水溫20℃的水槽中游泳，負(fù)重10%，以力竭為度（鼻尖沒入水中10 s）。且單日禁食，雙日足量自由飲食，造模21 d（造模過程中損耗部分大鼠）。實(shí)驗(yàn)第22天起，模型組與正常組中各取5只，經(jīng)腹主動脈采血，離心后檢測兩組大鼠的血清GAS、D-木糖濃度、CK活性，進(jìn)行驗(yàn)?zāi)＃啻笫罄^續(xù)實(shí)驗(yàn)，由于造模過程中模型組大鼠的損耗，將剩余的70只大鼠，隨機(jī)分為模型組14只、荷澤低劑量組14只、荷澤中劑量組14只、荷澤高劑量組14只、陽性組14只。

1.4 給藥方法 正常組及模型予蒸餾水灌胃3 mL/d，荷澤低、中、高劑量組分別予荷澤顆粒灌胃1.25 mL/d、2.5 mL/d、5 mL/d，陽性組予四君子湯灌胃4 mL/d，共14 d。

1.5 指標(biāo)檢測 分別于干預(yù)后的第7、14日各組各取7只大鼠處死。所有大鼠采血前1 h予3%D-木糖溶液灌胃，劑量2 mL/100 g［3］，1 h后，予10%水合氯醛麻醉。采用ELISA檢測方法檢測GAS、D-木糖濃度；采用生化檢測方法檢測CK活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用方差分析（LSD多重比較）和非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-wallis）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組脾虛證造模情況比較 見表1，圖1。造模期間，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量處于不增與下降的趨勢。造模7 d，除正常組外，各組均出現(xiàn)瞇眼、懶動、扎堆，體質(zhì)量減輕或不增，大便時干時稀，其間可見脫落的腸黏膜，背毛散亂無光澤，易散落，游泳耐力逐漸下降，此現(xiàn)象一直維持到造模結(jié)束。21 d后，與正常組比較，造模各組胃泌素、D-木糖濃度、CK活性均下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 兩組各數(shù)值比較（±s）

表1 兩組各數(shù)值比較（±s）

與模型組同期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別n GAS（pg/mL）D-木糖濃度（mmol/L）CK（IU/L）正常組模型組5 5 61.98±12.45 22.56±1.28△△1.52±0.16 0.55±0.06△3 722.4±79.26 1 403±116.74△△

圖1 兩組造模期間體質(zhì)量變化圖

2.2 各組干預(yù)前后大鼠體質(zhì)量比較 見表2。各組予相應(yīng)的藥物干預(yù)7 d后，各組體質(zhì)量明顯上漲，以荷澤中、高劑量組及陽性組增長更明顯，與模型組比較，各組均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；14 d后，各用藥組體質(zhì)量增長速度較前回落，與模型組比較，荷澤中、高劑量組及陽性各組差異具有顯著性（P＜0.05）。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

組 別n 干預(yù)前 干預(yù)后7 d 干預(yù)后14 d模型組荷澤低劑量組荷澤中劑量組荷澤高劑量組陽性組7 7 7 7 7 216.9±3.0 228.6±3.4 229.3±6.5 226.9±3.3 218.5±4.5 251.8±3.0 284.3±4.7△302.6±9.0△297.9±5.2△295.2±6.7△288.5±3.0 312.9±6.3 340.0±7.6△328.6±6.6△350.3±10.7△

2.3 各組大鼠血清GAS、D-木糖濃度比較 見表3。用藥7 d后，與模型組比較，陽性組、荷澤中劑量組血清GAS不同程度升高（P＜0.05或P＜0.01）；與正常組比較，各用藥組GAS較低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與模型組比較，陽性組、荷澤中、高劑量組血清D-木糖濃度不同程度升高（P＜0.05或P＜0.01）；與正常組比較，各組D-木糖濃度均較低（P＜0.05或P＜0.01）。用藥14 d后，與正常組比較，荷澤中劑量組、陽性組血清GAS、D-木糖濃度升高（均P＜0.05），此時與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清GAS、D-木糖濃度比較（±s）

表3 各組大鼠血清GAS、D-木糖濃度比較（±s）

組別正常組模型組荷澤低劑量組荷澤中劑量組荷澤高劑量組陽性組n 7 7 7 7 7 7 GAS（pg/mL）7 d 63.99±4.07**24.37±1.49△△35.58±2.97 50.37±5.48*38.58±6.53 52.90±4.72*14 d 67.61±9.26 46.79±2.90 68.86±5.76 102.97±11.59**△78.74±11.08*100.43±12.50**△D-木糖濃度（mmol/L）7 d 1.90±0.31*0.56±0.07△△0.67±0.93 1.02±0.07*△△0.79±0.28*1.40±0.13*△△14 d 2.17±0.13 1.92±0.14 2.18±0.19 2.63±0.12**△2.48±0.72*2.81±0.10**△

2.4 各組大鼠CK活性的影響劑量與時間效應(yīng)比較見表4。用藥7 d后，與模型組比較，荷澤低、中劑量組、陽性組CK不同程度升高（P＜0.05）；與正常組比較，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。至14 d后，模型組與正常比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清CK活性比較（±s）

表4 各組大鼠血清CK活性比較（±s）

組別正常組模型組荷澤低劑量組荷澤中劑量組荷澤高劑量組陽性組n 7 7 7 7 7 7 7 d 2 665.8±381.8△1 595.2±137.8 2 734.8±247.9△2 615.2±323.4△2 115.8±326.4 2 904.0±390.3△14 d 2 780.2±369.0 2 196.6±268.8 2 306.8±356.5 2 587.6±166.1 2 314.4±366.1 2 353.2±88.7

3 討 論

3.1 脾虛證候的造模方法 《脾胃論》云“大忌苦寒之藥傷其脾胃”，本次實(shí)驗(yàn)采取了苦寒瀉下、饑飽失常及勞倦過度復(fù)合因素造模法復(fù)制脾虛模。大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低、活動減少、便溏、毛發(fā)不澤等癥，其表現(xiàn)的各種虛弱癥狀與臨床脾虛癥狀相似，在一定程度上反映了脾虛狀態(tài)的病理改變，因而該模型有其中醫(yī)理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。眾多文獻(xiàn)推薦采用多因素復(fù)合造模方法，其一：單一因素造模，存在造模因素撤除后自然恢復(fù)快的問題［4］。因此，本次實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合因素，加大復(fù)制脾虛模型的力度，增強(qiáng)模型的穩(wěn)定性。楊云等用勞倦及饑飽造脾虛模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，表明此法模型復(fù)健期較長，較為穩(wěn)定［5］。其二：對一個證候而言，是有多種致病因素造成的，勞倦過度、饑飽失常法模擬現(xiàn)代人生活飲食不規(guī)律、作息不規(guī)律，休息時間少，本次實(shí)驗(yàn)造模方法貼近臨床。臨床上脾虛證的病因往往不是單一的，而是多種因素的共同作用結(jié)果，故綜合因素造模法才更接近臨床［6］。根據(jù)全國中西醫(yī)結(jié)合虛證老年病防治學(xué)術(shù)會議制訂的中醫(yī)虛證參考標(biāo)準(zhǔn)及北京師范大學(xué)造脾虛證模型標(biāo)準(zhǔn)，制定脾虛動物模型大致的標(biāo)準(zhǔn)是：1）泄瀉嚴(yán)重時甚至嚴(yán)重脫肛；2）食少納呆；3）消瘦，體質(zhì)量減輕；4）神態(tài)萎靡、四肢不收，毛色枯槁；5）蜷縮聚堆；6）易疲勞。第1、2項(xiàng)為主癥，第3～6項(xiàng)為兼癥，具備兩項(xiàng)主癥和兩項(xiàng)兼癥時，即可以認(rèn)為脾虛證造膜成功［7］。本次實(shí)驗(yàn)購120只Wistar大鼠，造模大鼠100只，實(shí)驗(yàn)過程中損耗15只，其余造模大鼠均達(dá)到上述的脾虛模型標(biāo)準(zhǔn)，其模型成功率達(dá)85%；且造模21 d后，與正常組比較，造模各組GAS、D-木糖濃度、CK活性均下降，且存在統(tǒng)計學(xué)差異，本次研究的模型不僅在癥狀上符合脾虛的標(biāo)準(zhǔn)，從客觀的指標(biāo)上，也提示造模組大鼠處于脾虛的狀態(tài)。

GAS作用于消化系平滑肌上的GAS受體，興奮與磷脂酶C耦聯(lián)的G蛋白，產(chǎn)生三磷酸肌醇，激發(fā)胃平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)，同時也是胃酸分泌的主要調(diào)節(jié)激素，與組胺、乙酰膽堿共同刺激壁細(xì)胞分泌胃酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脾虛胃腸動力障礙模型大鼠GAS明顯降低，用藥后GAS可升高。D-木糖是一種五碳糖，通常在血液中并不存在，口服后可在小腸被吸收，故口服D-木糖后在一定時間內(nèi)血和尿中D-木糖濃度基本上可以反映小腸吸收功能狀況。GAS使胃蛋白酶原分泌增多，消化道黏膜修復(fù)，因此，血清D-木糖吸收增加，其測得的濃度升高。因此，GAS、D-木糖濃度可以間接反映脾氣虛證的嚴(yán)重程度及治療后的恢復(fù)情況。本次研究結(jié)果顯示，造模21 d后，與正常組相比，模型組GAS、D-木糖濃度明顯降低。干預(yù)7 d后，與模型組相比，陽性組、荷澤中劑量組血清GAS不同程度升高；與正常組相比，各用藥組GAS值較低，但差異不具有顯著性。與模型組相比，陽性組、荷澤中劑量組D-木糖濃度均較高，差異具有顯著性；與正常組相比，各組D-木糖濃度均較低，差異具有顯著性。干預(yù)14 d后，荷澤中、高劑量組、陽性組GAS、D-木糖濃度與同期模型組相比，差異具有顯著性；與正常組相比，荷澤中劑量組、陽性組組GAS較正常組高，差異具有顯著性，而模型組則無顯著差異。GAS屬于胃腸激素，受中樞調(diào)節(jié)，在急性恢復(fù)期，GAS顯著增高，可能與反饋?zhàn)饔孟嚓P(guān)［10］，它能激發(fā)胃平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)，增強(qiáng)胃腸蠕動，同時使胃蛋白酶原分泌增多，消化道黏膜修復(fù)，與D-木糖濃度具有一定的相關(guān)性。CK主要存在于骨骼肌、心肌及腦組織中，在細(xì)胞能量代謝中起重要作用，催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的可逆反應(yīng)。CK作用生成的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時能量的直接來源［11］。根據(jù)CK的主要生理功能及本次實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果分析，脾虛模型的CK明顯降低，脾虛模型大鼠機(jī)體存在能量代謝障礙。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中，“脾主肌肉”的基本理論明確了脾胃功能與肌肉關(guān)系密切，脾虛癥狀可表現(xiàn)為肌肉瘦削，松軟無力。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模完成后血清CK活性顯著降低，干預(yù)7 d后，與模型組相比，荷澤低、中劑量組，陽性組CK不同程度增加，且差異具有顯著性；與正常組相比，各用藥組差異不具有顯著性；干預(yù)14 d后，模型組和正常組亦無統(tǒng)計學(xué)差異。徐琦等從脾氣虛模型大鼠血清中測定CK活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾氣虛大鼠CK低于正常組，自然恢復(fù)組及用藥組治療3周后，兩組均恢復(fù)正常，與正常組無統(tǒng)計學(xué)差異［12］，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 荷澤顆粒對脾虛大鼠的治療作用 本方本荷澤顆粒是湖北省中醫(yī)院兒科多位專家經(jīng)過多年的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，主要針對于兒童單純性肥胖中的脾虛濕盛證型，治療上以健脾利濕為原則。荷澤顆粒前期已進(jìn)行了本方配合飲食運(yùn)動療法治療兒童單純性肥胖的臨床研究，臨床有效率達(dá)86.7%［13］。此外，荷澤顆粒還可降低瘦素水平，升高脂聯(lián)素水平，在肥胖發(fā)生發(fā)展中起到調(diào)節(jié)能量代謝的重要作用［14］。全方由荷葉10 g，蒼術(shù)9 g，澤瀉9 g，薏苡仁9 g，山楂 6 g，決明子6 g，炒枳實(shí)3 g，知母3 g組成。全方以荷葉、蒼術(shù)為君藥，薏苡仁、澤瀉為臣藥，生山楂、炒枳實(shí)、草決明、知母均為佐助。諸藥合參，共奏健脾利濕、理氣消食潤腸之功。在中醫(yī)基本理論中，脾失健運(yùn)，不能正常運(yùn)化谷物和水液，水反為濕，濕則困脾，進(jìn)而影響氣機(jī)的運(yùn)行，導(dǎo)致氣機(jī)郁滯，進(jìn)一步出現(xiàn)精微不布，化為膏脂；反之，脾健，則水濕、膏脂可化［15］。荷澤顆粒既可用于脾虛濕盛型厭食證患兒，也可用于此種證型單純性肥胖患兒，體現(xiàn)了中醫(yī)異病同治的原則。本次實(shí)驗(yàn)證明，荷澤顆粒中劑量組與四君子湯療效相當(dāng)，對脾虛大鼠有可靠的治療作用。其他劑量組也有不同程度的療效，但不如中劑量組，低劑量組考慮與藥物濃度相關(guān)；高劑量組考慮灌胃量大，影響大鼠進(jìn)食。同時，隨著用藥時間的延長，胃泌素、D-木糖濃度明顯增高，但14d后，模型組與正常組間無統(tǒng)計學(xué)差異，說明大鼠具有一定的自我調(diào)節(jié)，其自愈性強(qiáng)，模型組動物的脾虛癥狀均有所恢復(fù)，模型持續(xù)期不長。