電刺激對脊髓損傷大鼠神經(jīng)再生及NRG-1/ErbB-PI3K/Akt通路的影響*

王 倩 朱 薇

（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710033；2.西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院，陜西 西安 710002）

脊髓損傷可導(dǎo)致原發(fā)性機(jī)械損傷、繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡、反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生和軸突無法再生。由于受損脊髓的無反應(yīng)環(huán)境，不會(huì)發(fā)生軸突再生［1-2］。脊髓損傷后功能的喪失可能來自主要的機(jī)械損傷和隨后的多方面的二次退行性反應(yīng)［3］。近年來，研究證明受損的脊髓功能可以恢復(fù)。電刺激被用作促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病后功能恢復(fù)的治療工具。電刺激的臨床應(yīng)用的實(shí)例包括用于恢復(fù)聽力的耳蝸植入物，用于恢復(fù)呼吸和手掌握的下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的刺激，以及用于治療帕金森病癥狀的深部腦刺激［4］。電刺激也被用于抵消與麻痹相關(guān)的失用性萎縮。電刺激在脊髓損傷患者的臨床環(huán)境中已得到應(yīng)用。研究脊髓損傷患者電刺激的實(shí)際益處包括：肌肉質(zhì)量增加、骨密度改善、心血管功能增強(qiáng)、改善腸功能、減少痙攣、膀胱感染率降低。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（NRG1）是ErbB受體的配體家族，其可明顯刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞生長能力［5］。NRG1在多種內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，包括：培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮、人冠狀動(dòng)脈和心內(nèi)膜內(nèi)皮，以及來自成年大鼠心室的冠狀微血管內(nèi)皮。研究證實(shí)，NRG1在脊髓神經(jīng)元中高表達(dá)，NRG1與ErbB的結(jié)合誘導(dǎo)其自身及其共同受體ErbB的磷酸化［6-8］。NRG1/ErbB信號通路在神經(jīng)信號通路信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能，包括抗凋亡和血管生成反應(yīng)。既往研究表明NRG1過表達(dá)對培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞具有PI3K/Akt依賴保護(hù)作用［9］。本研究擬探討電刺激對脊髓損傷大鼠神經(jīng)再生及NRG1-ErbB-PI3KAkt通路的影響，探討脊髓損傷的分子機(jī)制，為脊髓損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，12周齡，體質(zhì)量（200±20）g，空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2017-0005。動(dòng)物使用許可證號：SYXK（陜）2018-0012。

1.2 試劑及儀器 TrizolTM試劑（美國Invitrogen公司，批號69874）；TaqManTMmiRNAs Assay試劑盒（美國Applied Biosystems公司，批號32417）；RNeasy Mini Kit試劑盒（德國Qiagen公司，批號ab4063）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號180326）；Ultra SensitiveTMS-P試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，180128）；NRG1、ErbB、PI3K、Akt一抗（1∶100，武漢博士德生物工程有限公司，批號：604315、602317、602346、607125）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、蘇木精溶液（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號30625、30419）。XE-98 MEP儀器（美國Axon公司）；安捷倫Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；組織冷凍培養(yǎng)基（美國熱電公司）；CM1850低溫恒溫器（德國徠卡）；振蕩電場刺激器（中國科學(xué)院電氣工程研究所）。

1.3 模型制備 將大鼠隨機(jī)分成3組：對照組、模型組、電刺激組，每組20只。模型組、電刺激組測量大鼠的初始體質(zhì)量，然后腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g體質(zhì)量）麻醉大鼠，用膠帶將每只大鼠的四肢和頭部固定在手術(shù)臺(tái)上，然后用3%碘溶液對皮膚進(jìn)行消毒。在T10棘突的中心沿著背部的中線進(jìn)行縱向切口，長度約為2 cm，然后將組織層切開以顯示T9～T11薄層和棘突，用微型剪刀切割 T9～T11棘突，小心地提起T10椎板以避免撕裂肋骨并損傷血管，隨后暴露T10脊髓，然后將大鼠固定在大鼠脊髓減重裝置上，通過使10 g金屬棒從5 cm的高度自由落到大鼠的脊髓上誘導(dǎo)脊髓損傷，當(dāng)大鼠的脊髓被擊中時(shí)，大鼠的尾巴或后腿抽搐。誘導(dǎo)脊髓損傷后，電刺激組振蕩電場刺激器的兩個(gè)電極用不可吸收的縫合線固定在T9和T12棘突的兩側(cè)，然后逐步移除切口縫合線，術(shù)后每日腹腔注射100 000單位的青霉素，連續(xù)3 d，以防止感染。誘導(dǎo)脊髓損傷大鼠每天被動(dòng)排尿2～3次，直到建立自動(dòng)排尿，在被動(dòng)排尿時(shí)，用左手抬起腹部，用右手搜尋填充的膀胱，一旦定位，膀胱從底部被擠壓，直到尿液逐漸排出，會(huì)陰部保持干燥以防止感染。

1.4 干預(yù)方法 術(shù)后第3天使用振蕩電場刺激器對電刺激組給予電刺激治療，振蕩電場刺激器設(shè)置參數(shù)為：強(qiáng)度為40 μA，脊髓上的電場強(qiáng)度為400 μV/mm，振蕩周期的持續(xù)時(shí)間為15 min。每日1次，連續(xù)7周。

1.5 機(jī)械痛閾（PWT）及熱刺激潛伏期（PWTL）的測定 各組大鼠處死前，將大鼠置于透明觀測盒里，用秒表計(jì)時(shí)，從大鼠后足與托盤接觸到出現(xiàn)踮腳、回縮、舔足、掙扎記為大鼠的熱刺激縮足反射潛伏期，測定PWT、PWTL［10］。

1.6 脊髓損傷的行為學(xué)評分（BBB）及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP）的測定 BBB評級是評估脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能最常用的評估方法之一，分為21個(gè)等級。它還用于觀察后肢活動(dòng)，包括后肢每個(gè)關(guān)節(jié)活動(dòng)的數(shù)量和范圍，支撐身體的能力，以及前肢和后肢之間的協(xié)調(diào)。此外，它可以分為早期運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，中期協(xié)調(diào)，晚期精細(xì)活動(dòng)。在BBB評級完成后，將所有組中的大鼠麻醉，然后通過使用MEP儀器檢測MEP，將兩對刺激針電極放置在T7/8和L1/2椎板之間的間隙附近，正電極指向前部，負(fù)電極指向后部。兩個(gè)電極之間的距離范圍為0.5～0.8 cm，設(shè)定以下參數(shù)：脈沖寬度0.05 ms，輸出強(qiáng)度100～150 V。然后將電極置于腓腸肌的兩側(cè)，記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位作為最終值。

1.7 脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平的測定 用Trizol試劑從脊髓中分離總RNA，使用Taqman miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，并使用Taq-ManTMmiRNAs Assay試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。將NRG1、ErbB、PI3K。kt表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為U6，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，使用RNeasy Mini Kit試劑盒從脊髓組織分離的總RNA用隨機(jī)六聚體和Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。NRG1、ErbB、PI3K、Akt引物如下：NRG1 正向：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，反向：5′-TCACGCCACAGTTTCCC GGA-3′。ErbB 正向：5′-ATTCGTAGAGGATTGACG-3′，反向：5′-AACTGCTACAGTTTTCCGTAT-3′。PI3K正向 ：5′-CCTAGGACTTGCTTA-3′，反 向 ：5′-CCTAAGCACAGTCCTGACTG-3′。Akt正 向 ：5′-CGTAGCTACTCCTGGGA-3′，反 向 ：5′-CCTGACTGACACAGT CCTGGGACCT-3′。U6 正向：5′-CGCCTAGTCCTGGG AATGA-3′，反向 ：5′-CCTAGTAGGTACACAGTCCTGGCCTGAGA-3′。熱循環(huán)：1個(gè)循環(huán)，94℃，3 min；30個(gè)循環(huán)，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，68 ℃ 90 s；然后是72 ℃10 min。獲得 Ct值，并使用 2-ΔΔCt的方法計(jì)算相對表達(dá)，根據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：ΔCt（靶基因）=Ct（靶基因）-Ct（參考基因）。

1.8 脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平的測定 試驗(yàn)結(jié)束后，通過腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露胸部，用0.9%氯化鈉注射液連續(xù)灌注肝臟的頂點(diǎn)直至顏色變白。將組織用4%多聚甲醛灌注30 min并在4%甲醛中固定12 h后，取出位于末端附近1 cm處的受損脊髓和脊髓組織，然后將切片包埋在最佳冷卻溫度組織冷凍培養(yǎng)基中，通過低溫恒溫器將冷凍切片橫向切片，厚度為10 μM。待定免疫組織化學(xué)超敏性Ultra SensitiveTMS-P試劑盒制備FFPE組織切片。在二甲苯中脫蠟并在一系列分級醇中再水合，將切片熱固定并阻斷過氧化物酶活性，與蛋白質(zhì)封閉溶液一起溫育。隨后將切片與針對NRG1、ErbB、PI3K、Akt的抗人兔Mobility抗體一起溫育，接著與二抗溫育。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）用作色原體，切片用蘇木精溶液復(fù)染，脫水并固定，使用雙盲法評估所有載玻片，對于每個(gè)切片，選擇5個(gè)高倍視野（400倍）并在每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，將染色強(qiáng)度和陽性面積百分比組合以解釋FOXP3和TLR4免疫組織化學(xué)反應(yīng)性；如下，染色強(qiáng)度：0=無染色，1=灰色，2=黃色，3=棕色；陽性區(qū)域：0表示≤5%，1表示 6%～25%，2表示26%～50%，3表示51%～75%，4表示＞75%。將染色強(qiáng)度和陽性面積的值相乘以得到最終得分，0～2的評分為陰性，3～4為弱陽性，6～8為中度陽性，9～12為強(qiáng)陽性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠PWT、PWTL、BBB、MEP潛伏期評分比較 見表1。與對照組比較，模型組PWT、PWTL、BBB評分水平降低，MEP潛伏期升高（P＜0.05）；與模型組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分升高，MEP潛伏期降低（P＜0.05）；與對照組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分水平略微降低，MEP潛伏期略微升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠PWT、PWTL、MEP潛伏期及BBB評分比較（±s）

表1 各組大鼠PWT、PWTL、MEP潛伏期及BBB評分比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組 別n PWT（g）PWTL（S）BBB評分（分）MEP潛伏期（ms）對照組模型組電刺激組20 20 20 36.14±6.12 12.65±6.36*35.32±5.19△21.34±3.45 7.86±2.98*20.77±3.34△20.13±3.95 8.54±2.39*18.54±2.69△6.24±1.36 52.36±6.85*7.00±3.24△

2.2 各組大鼠脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)的比較 見圖1。對照組脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)正常、脊髓神經(jīng)元細(xì)胞完整；模型組脊髓中心灰質(zhì)區(qū)見小片狀被破壞，白質(zhì)內(nèi)大量體積小囊泡形成，呈蟲蝕樣改變；電刺激組白質(zhì)內(nèi)大量體積小囊泡數(shù)目減少，脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)趨于正常，小片狀被破壞面積減少。

圖1 各組大鼠脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平比較 見表2。與對照組比較，模型組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與對照組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平略微降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別對照組模型組電刺激組n 20 20 20 NRG1 mRNA 1.79±0.13 0.85±0.14*1.58±0.13△ErbB mRNA 2.15±0.18 1.54±0.13*1.98±0.13△PI3K mRNA 1.76±0.17 0.98±0.12*1.58±0.17△Akt mRNA 1.94±0.11 0.56±0.13*1.73±0.18△

2.4 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平比較 見表3，圖2～圖5。與對照組比較，模型組NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與對照組比較，電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平略微降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化法下，NRG1、ErbB、PI3K、Akt陽性表達(dá)為棕褐色，NRG1、ErbB、PI3K、Akt陽性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。

表3 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，±s）

表3 各組大鼠脊髓組織NRG1、ErbB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，±s）

組別對照組模型組電刺激組n 20 20 20 NRG1 236.54±14.63 86.65±19.96*200.63±16.98△ErbB 187.96±16.65 103.65±19.96*169.65±17.63△PI3K 183.67±15.63 71.14±16.78*180.73±13.65△Akt 145.77±6.46 67.86±6.98*143.45±6.98△

圖2 各組大鼠脊髓區(qū)NRG1蛋白表達(dá)（DAB染色，400倍）

圖3 各組大鼠脊髓區(qū)ErbB蛋白表達(dá)（DAB染色，400倍）

圖4 電刺激對大鼠脊髓區(qū)PI3K蛋白表達(dá)水平（DAB染色，400倍）

圖5 各組大鼠脊髓區(qū)Akt蛋白表達(dá)（DAB染色，400倍）

3 討 論

電刺激對脊髓損傷患者有益，失去下肢功能的脊髓損傷患者由于動(dòng)態(tài)能力有限，可能會(huì)出現(xiàn)明顯的肌肉萎縮和一般健康狀況下降，通過神經(jīng)肌肉電刺激，這些個(gè)體的癱瘓肢體可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)和力量，電刺激可增強(qiáng)脊髓損傷患者站立、劃船、踩踏、伸展和行走的能力。越來越多的證據(jù)表明，電刺激可以促進(jìn)損傷后的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)［11］。在大鼠股神經(jīng)橫斷和修復(fù)的模型中，電刺激促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）釋放并增強(qiáng)穿過遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端的優(yōu)先運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再支配，這種刺激范例也促進(jìn)了股神經(jīng)修復(fù)后的功能恢復(fù)［12-13］。本研究結(jié)果顯示，模型組PWT、PWTL、BBB評分水平降低，MEP潛伏期升高；與模型組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分升高，MEP潛伏期降低；與對照組比較，電刺激組PWT、PWTL、BBB評分水平略微降低，MEP潛伏期略微升高。這與上述研究結(jié)果符合，同時(shí)提示電刺激能減輕大鼠脊髓損傷程度，促進(jìn)損傷神經(jīng)再生。結(jié)合損傷脊髓病理結(jié)果，對照組脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)正常、脊髓神經(jīng)元細(xì)胞完整；模型組脊髓中心灰質(zhì)區(qū)見小片狀被破壞，白質(zhì)內(nèi)大量體積小囊泡形成，呈蟲蝕樣改變；電刺激組白質(zhì)內(nèi)大量體積小囊泡數(shù)目減少，脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)趨于正常，小片狀被破壞面積減少。這提示電刺激能恢復(fù)受損脊髓結(jié)構(gòu)，減輕脊髓損傷。

NRG1是一種特定的生長因子，其在軸突表面表達(dá)，與ErbB受體酪氨酸激酶結(jié)合由施萬細(xì)胞表達(dá)，并作為髓鞘形成的觸發(fā)分子，因此，NRG1/ErbB信號傳導(dǎo)的強(qiáng)度決定施萬細(xì)胞是否產(chǎn)生髓鞘以及產(chǎn)生多少髓鞘［14-15］。由于少突膠質(zhì)細(xì)胞也對NRG1有反應(yīng)，因此在神經(jīng)系統(tǒng)中少突膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的髓鞘形成過程中可能存在這種NRG1/ErbB信號傳導(dǎo)機(jī)制，NRG1通過與ErbB3或ErbB4結(jié)合而發(fā)揮作用；然后，每種受體與ErbB2異二聚體化，ErbB2不能直接結(jié)合NRG1，但具有活性激酶結(jié)構(gòu)域。施萬細(xì)胞主要表達(dá)ErbB2和ErbB3，但少突膠質(zhì)細(xì)胞以發(fā)育調(diào)節(jié)的方式表達(dá)所有3種ErbB受體［16-18］。已顯示該信號傳導(dǎo)在髓鞘形成過程中調(diào)節(jié)髓鞘形成的施萬細(xì)胞的形態(tài)和基因表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NRG1/ErbB信號傳導(dǎo)涉及廣泛的過程，包括神經(jīng)元遷移，軸突尋路和突觸可塑性。體外研究表明［19］，這種信號傳導(dǎo)影響少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，分化，髓鞘形成和存活。研究表明［20］，PI3K/AKT通路激活通過調(diào)節(jié)抗凋亡和自噬反應(yīng)在脊髓損傷中起著重要的神經(jīng)保護(hù)作用。Akt磷酸化可削弱神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)下游分子的表達(dá)，如裂解的Caspase-3、6、9，Bcl-2和Bax，導(dǎo)致Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物的解離，該過程釋放Beclin-1并導(dǎo)致自噬反應(yīng)。PI3K激酶抑制劑LY294002可阻斷了自噬體形成，PI3K/AKT途徑的激活可抑制脊髓損傷后的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白表達(dá)水平降低；電刺激組NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白表達(dá)水平較模型組升高，同時(shí)與對照組比較無明顯差異。這提示電刺激可促進(jìn)NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)脊髓損傷大鼠神經(jīng)再生。

綜上所述，電刺激能減輕大鼠脊髓損傷程度，促進(jìn)損傷神經(jīng)再生；其機(jī)制與電刺激激活NRG1-ErbBPI3KAkt通路，促進(jìn) NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA、蛋白的表達(dá)有關(guān)。