真武湯對(duì)腎陽(yáng)虛水腫大鼠模型的保護(hù)作用及對(duì)IL-17表達(dá)的影響*

崔言坤 高彥宇 高博文 楊楚琪 李 冀

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150000）

腎為水之臟，腎陽(yáng)虛水無所制，則泛溢而為腫。腎陽(yáng)虛水腫指先天稟賦不足，后天失養(yǎng)，或年老體衰，或久病失養(yǎng)以致腎陽(yáng)虛衰，膀胱氣化失司，水液停留體內(nèi)，臨床常表現(xiàn)為頭面、四肢甚至全身浮腫，小便不利或夜尿頻多，腰重足冷［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于水腫一病，主要依賴于利尿劑、白蛋白等對(duì)癥處理方案，而中醫(yī)辨證論治的特色治療手段，療效顯著。前期通過采用數(shù)據(jù)挖掘的方法，對(duì)臨床治療腎陽(yáng)虛水腫選方用藥經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行分析，基于聚類分析基礎(chǔ)上選取真武湯作為實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。真武湯源自漢·張仲景所著之《傷寒論》，由炮附子、茯苓、白術(shù)、白芍、生姜組成，乃是溫陽(yáng)化水之代表方劑，臨床應(yīng)用廣泛，不僅用于腎臟疾病的治療，如腎病綜合征、糖尿病腎病、心腎綜合征等，還多用于循環(huán)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等一系列表現(xiàn)為腎陽(yáng)虛的病證［2］。有研究顯示，真武湯藥理作用是通過多路徑實(shí)現(xiàn)的，其作用機(jī)制與調(diào)整垂體-腎上腺素軸、調(diào)節(jié)滲透壓調(diào)定點(diǎn)、調(diào)控細(xì)胞凋亡等都密切相關(guān)［3］。本研究通過病癥結(jié)合的模式，建立腎陽(yáng)虛水腫模型，利用現(xiàn)代科學(xué)手段深入探討真武湯“溫陽(yáng)利水”的作用及其機(jī)理，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)SD大鼠，4～5周齡，體質(zhì)量200～230 g，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為：SCXK（京）2019-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫18～24℃、相對(duì)濕度40%～50%，給予自由飲水及標(biāo)準(zhǔn)飼料，實(shí)驗(yàn)期間保持晝夜節(jié)律正常。本研究獲得黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則，批準(zhǔn)號(hào)：2019051001。

1.2 試藥與儀器 真武湯，組方：炮附子、茯苓、白術(shù)、芍藥、生姜按3∶3∶2∶3∶3比例稱質(zhì)量（購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局）。各藥物先以10倍量蒸餾水浸泡，煎煮3次，每次1 h，減壓濃縮成生藥量1.9 g/mL的藥液，備用。氫化可的松（上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H41021930）；注射用鹽酸阿霉素（山西普德藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023143）；鹽酸貝那普利（北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030514）；大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、醛固酮（ALD）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20190725）。尿蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20191213）；低溫高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；OLYMPUS BX42電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；YT-6B組織貼片機(jī)（北京凱揚(yáng)自動(dòng)化科技有限公司）；RM2135石蠟組織切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；Tecan infinite 200 PRO酶標(biāo)儀（鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司）。

1.3 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后制備腎陽(yáng)虛模型。除正常組8只大鼠外，其余大鼠于第1日及第8日早8∶00通過尾靜脈注射阿霉素溶液，兩次注射劑量分別為3.5、3 mg/kg；同時(shí)，每天腹腔注射氫化可的松，注射劑量為3.75 mg/kg，連續(xù)14 d。

1.4 分組與給藥 將造模成功的大鼠24只隨機(jī)分為模型組、真武湯組、陽(yáng)性藥組，每組8只。真武湯組每日灌胃1.9 g/mL真武湯藥溶液；陽(yáng)性藥組灌胃1.2 mg/mL鹽酸貝那普利；其余各組灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)21 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）實(shí)驗(yàn)過程中，記錄大鼠行為活動(dòng)，毛發(fā)狀態(tài)，進(jìn)食情況，糞便情況，體質(zhì)量。2）于造模后及末次給藥后，將大鼠分別置于代謝籠中，收集24 h尿液，并記錄尿量，4℃、3 500 r/min離心15 min，取上清，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染料結(jié)合法（CBB），檢測(cè)大鼠24 h尿液尿蛋白定量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。3）末次給藥24 h后腹主動(dòng)脈采血，4℃、3 500 r/min離心10 min，2次，取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀，測(cè)定血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）含量。4）采用酶聯(lián)免疫吸附法，按照試劑盒說明檢測(cè)血清中cAMP、cGMP、ALD、IL-17含量。5）免疫組化法檢測(cè)腎臟組織IL-17表達(dá)。取腎臟組織常規(guī)脫蠟、封閉，滴加IL-17抗體，4℃孵育12 h，滴加二抗，顯微鏡下DAB顯色，封片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察 見表1。正常組大鼠被毛光澤，反應(yīng)迅速，二便正常；與正常組比較，造模后各組大鼠精神萎靡、毛發(fā)枯槁、聚堆、大便稀薄，體質(zhì)量減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功；給藥第21日，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢（P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組和陽(yáng)性藥組體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)（P＜0.01）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別正常組模型組真武湯組陽(yáng)性藥組n 8 8 8 8造模第1日249.01±9.14 246.74±15.38 250.21±6.82 249.95±8.99造模第14日288.32±9.26 259.32±12.18**258.99±8.55△△262.85±10.85△△給藥第21日344.65±14.54 234.52±12.81**296.57±8.08△△281.08±18.56△△

2.2 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白定量比較 見表2。造模后，與正常組比較，各組大鼠尿蛋白及尿量均顯著升高（P＜0.01），提示造模成功；給藥后，與模型組比較，真武湯組和陽(yáng)性藥組尿蛋白及尿量均顯著下降（P＜0.01）。

表2 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白定量比較（±s）

表2 各組大鼠24 h尿量及尿蛋白定量比較（±s）

組別正常組（n=8）模型組（n=8）真武湯組（n=8）陽(yáng)性藥組（n=8）時(shí)間造模第14日給藥第21日造模第14日給藥第21日造模第14日給藥第21日造模第14日給藥第21日24 h尿量（mL）50.27±4.69 51.21±4.67 33.02±4.73**23.41±6.49**32.71±5.44**44.37±5.57△△33.57±5.66**42.49±6.61△△2 h尿蛋白（mg/dL）5.92±1.36 6.26±1.33 22.45±4.59**28.61±2.68**16.49±.191**18.65±1.90△△16.98±1.77**19.58±1.40△△

2.3 各組大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較 見表3。與正常組比較，模型組大鼠cAMP、cAMP/cGMP水平降低，cGMP水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組cAMP、cAMP/cGMP水平升高，cGMP水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較（±s）

組別正常組模型組真武湯組陽(yáng)性藥組n 8 8 8 8 cAMP（nmol/L）52.69±10.23 32.41±5.13*42.35±6.04△40.19±5.55 cGMP（nmol/L）9.65±0.84 12.09±3.14 10.32±1.51 10.49±1.76 cAMP/cGMP 5.24±1.31 2.86±0.82**4.12±0.37△△3.79±0.96

2.4 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較 見表4。與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組和陽(yáng)性藥組Scr、BUN含量均顯著下降（P＜0.05）。

表4 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（mmol/L，±s）

表4 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（mmol/L，±s）

組別正常組模型組真武湯組陽(yáng)性藥組n 8 8 8 8 Scr 52.61±6.65 65.07±5.92*56.08±6.04△52.82±9.69△BUN 9.49±3.22 16.83±3.51**11.29±3.28△10.77±3.09△

2.5 各組大鼠血清ALD、IL-17含量比較 見表5。與正常組比較，模型組大鼠ALD、IL-17含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，真武湯組和陽(yáng)性藥組ALD、IL-17含量均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠血清ALD、IL-17含量比較（±s）

表5 各組大鼠血清ALD、IL-17含量比較（±s）

組 別n ALD（mL/kg）IL-17（ng/L）正常組模型組真武湯組陽(yáng)性藥組8 8 8 8 234.52±62.56 446.14±80.51**303.72±65.76△274.16±60.61△△14.34±2.66 30.67±5.86**16.26±3.67△△17.26±4.41△△

2.6 各組大鼠腎臟IL-17表達(dá)比較 見圖1。結(jié)果顯示，正常組腎臟組織中有少量IL-17表達(dá)，多集中在腎小管；與正常組比較，模型組IL-17在腎小管上表達(dá)顯著，腎小球有少量表達(dá)，呈深棕色；與模型組比較，真武湯組和陽(yáng)性藥組IL-17表達(dá)明顯降低，弱陽(yáng)性表達(dá)，呈淺棕色。

圖1 各組大鼠腎臟IL-17表達(dá)（DAB染色，400倍）

3 討 論

近年來，隨著中醫(yī)藥在許多疾病的治療上顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，利用現(xiàn)代藥理學(xué)手段建立中醫(yī)病癥結(jié)合模型，已經(jīng)成為科研的必要方式。本實(shí)驗(yàn)選取氫化可的松聯(lián)合阿霉素方式，通過腹腔注射氫化可的松干預(yù)下丘腦-垂體-靶腺軸模擬傳統(tǒng)中醫(yī)病因?qū)W復(fù)制大鼠腎陽(yáng)虛模型［4］，同時(shí)尾靜脈注射阿霉素誘導(dǎo)腎源性水腫，從而建立大鼠腎陽(yáng)虛水腫模型［5］。阿霉素及其代謝產(chǎn)物可直接損傷足細(xì)胞，導(dǎo)致濾過膜的分子屏障受損而引發(fā)蛋白尿，其具有的腎毒性會(huì)進(jìn)一步促使炎性細(xì)胞分泌，破壞腎小管上皮細(xì)胞，從而引起水腫病癥［6］。氫化可的松可抑制促腎上腺皮質(zhì)激素分泌，使下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）反饋受到抑制，當(dāng)外來皮質(zhì)激素突然撤退，則暴露出HPA軸的抑制狀態(tài)，繼而表現(xiàn)出一系列陽(yáng)虛癥狀，且其所具有的腎毒性，會(huì)進(jìn)一步加重腎臟水腫［7］。

腎陽(yáng)虛則機(jī)體失于溫煦，陰寒內(nèi)生，氣化功能失調(diào)，表現(xiàn)出一系列癥狀，如神疲乏力，四肢不溫，大便稀溏等構(gòu)建腎陽(yáng)虛模型需要確保其符合臨床實(shí)際［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后各組大鼠均表現(xiàn)出一定程度的倦怠少動(dòng)，不欲飲食，體質(zhì)量下降，被毛枯槁，便溏，符合腎陽(yáng)虛證。cAMP與cGMP是一對(duì)相互拮抗又制約的物質(zhì)，共同參與細(xì)胞的調(diào)控，這與中醫(yī)學(xué)“陰陽(yáng)學(xué)說”相對(duì)應(yīng)［9］。研究報(bào)道，陽(yáng)虛時(shí)表現(xiàn)為cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP降低，因此通常將cAMP、cGMP含量作為腎陽(yáng)虛模型的考察指標(biāo)之一［9］。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)廣泛存在于人體組織中，在體液調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用，ALD是其重要的活性因子之一［10］。ALD是人類主要的鹽皮質(zhì)激素之一，在腎臟疾病中可作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是調(diào)節(jié)機(jī)體水鹽代謝的基礎(chǔ)，作用于遠(yuǎn)端小管，具有排鈉保鉀作用，同時(shí)在受體活化介導(dǎo)下具有促纖維化和促炎的作用［11］；有研究報(bào)道，ALD水平與水腫呈正相關(guān)，可能與其通過激活鹽皮質(zhì)激素受體，損傷大鼠足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬相關(guān)［12］。蛋白尿是水腫的重要指標(biāo)，腎功能也與其緊密相關(guān)，Scr和BUN是常用的腎功能檢測(cè)指標(biāo)，二者血清水平變化反映了腎小球?yàn)V過率的改變。IL-17是TH17細(xì)胞重要效應(yīng)分子之一，由多種免疫細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)而加重炎癥反應(yīng)，損傷靶器官，研究證實(shí)，IL-17與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可直接誘導(dǎo)腎臟足細(xì)胞的凋亡，且與蛋白尿水平呈正相關(guān)［13］。

真武湯是溫陽(yáng)利水之代表方劑，《古今名醫(yī)方論》謂真武湯“真武一方，為北方行水而設(shè)”［14］。方中附子為君，走腎溫經(jīng)，峻補(bǔ)元陽(yáng)；茯苓甘淡滲濕，益脾助陽(yáng)，白術(shù)甘苦而溫，燥濕實(shí)脾，二者共為臣藥；生姜辛溫，既助附子化氣，又可助苓、術(shù)溫中健脾；芍藥酸斂，既防附子傷陰，又緩急止痛，并取其利小便行水之功，全方諸藥相配，共奏溫陽(yáng)利水之功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，真武湯組大鼠一般情況得到改善，體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)，cAMP、cAMP/cGMP水平顯著升高，cGMP水平顯著降低，說明真武湯顯著改善了陽(yáng)虛癥狀；尿蛋白、BUN、Scr顯著降低，尿量顯著升高，提示真武湯能有效改善腎功能；同時(shí)，血清ALD、IL-17顯著升高，腎臟組織IL-17表達(dá)增強(qiáng)。

綜上，真武湯對(duì)腎陽(yáng)虛水腫有治療作用，通過改善腎臟功能，調(diào)劑HPG軸達(dá)到利尿消腫的功效，其機(jī)制可能與抑制IL-17介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為進(jìn)一步拆分真武湯有效組分配伍奠定了基礎(chǔ)。