超聲波輔助法提取百香果殼中黃酮的工藝及其抗氧化性研究

張會(huì)香，楊世軍，藍(lán)華生，蔡愛(ài)華

（1.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541006；2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，桂林廣西541004）

百香果（passion flower）又稱西番蓮、雞蛋果，屬西番蓮科，西番蓮屬植物，原產(chǎn)澳大利亞和巴西，屬于熱帶多年生草質(zhì)至半木質(zhì)藤本攀附果樹(shù)，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前在中國(guó)的廣東、廣西、海南、福建等地有大量種植[1-2]。百香果果汁具有番石榴、菠蘿、香蕉、芒果、蘋果、酸梅等多種水果的令人愉悅的香味[3]。研究發(fā)現(xiàn)，百香果果殼中豐富的碳水化合物、多糖、黃酮和多酚類物質(zhì)[4-5]。百香果果殼的乙醇、水提取物均能有效清除DPPH·和·OH，證明其提取物具有良好的抗氧化活性[5-7]。研究表明，黃酮類化合物是一類有著多方面藥理作用和生物活性的物質(zhì)，在預(yù)防癌癥、抗過(guò)敏、抗炎癥、抗病毒、抗糖尿病并發(fā)癥等方面都具有活性，同時(shí)黃酮類化合物還是一種自然界存在的理想的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子的自由基、抗衰老、增加機(jī)體免疫等生物活性[8-9]。

目前對(duì)百香果應(yīng)用除了部分鮮食之外主要用于加工果汁產(chǎn)品，因此，大量的果殼被作為殘?jiān)鼜U棄掉，造成大量的浪費(fèi)，同時(shí)又污染環(huán)境。

超聲波輔助提取法又被稱為超聲波萃取或者超聲波輔助萃取法，主要是利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，顯著提高提取效率的方法[10-12]。且超聲輔助提取可節(jié)約溶劑，避免高溫對(duì)提取成分的影響。因此，目前在天然植物有效成分提取中超聲波輔助提取法被廣泛應(yīng)用。

因此，本文通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，利用超聲波輔助乙醇提取法對(duì)百香果果殼中的黃酮類化合物進(jìn)行提取并研究其抗氧化活性，為綜合開(kāi)發(fā)利用百香果果殼提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果果殼（紫果）：桂林市雁山鎮(zhèn)。

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、抗壞血酸、硝酸鋁：以上試劑均為分析純，西隴化工股份有限公司。

蘆?。╮utinhydrate）對(duì)照品、DPPH：美國(guó) sigma 公司；聚酰胺樹(shù)脂（80 目～100 目）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；XH-300A 電腦微波超聲波組合合成/萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；HL-2B 型恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；電腦全自動(dòng)部分收集器：上海琪特分析儀器有限公司；TU-1950 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10 型酸度計(jì)、BS2245 型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FW100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及制備過(guò)程

選擇完整無(wú)破損的百香果，取下果殼，將其洗凈、烘干、粉碎、過(guò)80 目篩，置于干燥器中備用。

稱取一定量的干燥粉末樣品，按照一定比例的料液比加入不同濃度的乙醇，在一定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行超聲波輔助提取，將提取液抽濾，濾液即為黃酮粗提液。采用聚酰胺柱層析法進(jìn)行黃酮粗提取的純化，上樣流速為0.5 mL/min，用蒸餾水、70%乙醇溶液進(jìn)行順序洗脫，洗脫速度為1 mL/min，分段收集洗脫液，合并純化液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到黃酮純化液，測(cè)定黃酮含量，得到的樣品純度為20.08 %，回收率為82.95%。

1.3.2 黃酮含量測(cè)定方法

精確稱量干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.23 mg，用60 %乙醇加熱溶解定容至100 mL，得濃度為0.102 3 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。參考陳志紅等[13]報(bào)道的方法，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法做線性回歸，得到蘆丁濃度X 和吸光度Y 的關(guān)系曲線的回歸方程Y=13.532X-0.001 6，R2=0.999 8，線性范圍 5.115 μg/mL ～40.92 μg/mL。

準(zhǔn)確吸取樣品溶液1 mL，用60%乙醇定容至5 mL置于10 mL 容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮含量C（mg/mL）。黃酮提取率為黃酮質(zhì)量與百香果果殼樣品質(zhì)量之比。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

固定料液比為 1 ∶50（g/mL），超聲功率 200 W，超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間20 min，分別以30 %、40 %、50 %、60%、70%、80%的乙醇溶液為溶劑提取黃酮，比較不同濃度乙醇對(duì)提取率的影響。

1.3.3.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度60%，超聲溫度30 ℃，超聲功率200 W，超聲時(shí)間20 min，分別設(shè)定料液比為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），比較不同料液比對(duì)提取率的影響。

1.3.3.3 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL），超聲溫度 30 ℃，分別以 160、200、240、280、320、360 W 的超聲功率進(jìn)行提取，比較不同超聲功率對(duì)提取率的影響。

1.3.3.4 超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL），超聲功率 200 W，分別以 30、40、50、60、70、80 ℃的超聲溫度進(jìn)行提取，比較不同超聲溫度對(duì)提取率的影響。

1.3.3.5 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度 60%，料液比 1 ∶40（g/mL）超聲功率 200 W，超聲溫度 60 ℃，分別以 20、30、40、50、60、70 min 的超聲時(shí)間進(jìn)行提取，比較不同超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素的研究基礎(chǔ)上，選用L16（45）正交表，以黃酮提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳提取條件。因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The experimental factors and levels of orthogonal test

1.3.5 黃酮抗氧化活性的測(cè)定

1.3.5.1 水楊酸法測(cè)定黃酮抗氧化活性

采用Fenton 試劑法[14]，在10 mL 試管中分別加入1.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL、9 mmol/L 水楊酸 1.00 mL，分別加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的百香果黃酮提取液，另一支試管以蒸餾水為參比，做空白試驗(yàn)比較，最后分別加9 mmol/L H2O21.00 mL 搖勻，加蒸餾水定容至10 mL，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度?？紤]到提取液自身的吸光度，按前述同樣的方法，區(qū)別是不加H2O2，作為提取液的本底吸收AX0。同時(shí)配制相同濃度梯度的VC溶液為對(duì)照品，加入 1.5 mmol/L FeSO4溶液 1.00 mL、9 mmol/L 水楊酸1.00 mL、9 mmol/L H2O21.00 mL 搖勻，加蒸餾水定容至10 mL，在 37 ℃水浴中反應(yīng) 30 min，在 510 nm 處測(cè)定吸光度。即為對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果，與黃酮提取物比較抗氧化活性大小。

計(jì)算公式：

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；AX為樣品組吸光度；AX0為提取液本底組吸光度。

1.3.5.2 DPPH 法測(cè)定黃酮抗氧化活性

參考王雅等[15]的方法在10 mL 試管中分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的百香果黃酮提取液和 3 mL現(xiàn)配的0.1 mmol/L DPPH 緩沖液，95 %乙醇定容至10 mL，混合均勻，另一只試管以95%乙醇為參比，做空白試驗(yàn)比較。同時(shí)配制相同濃度梯度的VC溶液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)?？紤]到提取液自身的吸光度，按前述同樣的方法，區(qū)別是不加DPPH，作為提取液的本底吸收Aj。

計(jì)算公式：

式中：AC為空白對(duì)照試驗(yàn)吸光度；Ai為樣品吸光度；Aj為不加DPPH 提取液的本底吸光度。

1.3.5.3 鄰苯三酚自氧化法測(cè)定黃酮抗氧化活性

參考陳志紅[16]等的方法吸取不同濃度的黃酮提取液1 mL，分別加入pH8.2 濃度為50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，隨后加入4.2 mL 蒸餾水（自氧化）混勻，放置于25 ℃水浴鍋內(nèi)保溫20 min 后取出，立即加入事先預(yù)熱（25 ℃）的3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 mL（用10 mmol/L 的HCl 配制）。空白試驗(yàn)組加0.3 mL 10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚溶液。加入試劑后迅速搖勻，倒入比色皿中，在325 nm 下測(cè)定5 min 后的測(cè)定吸光度。同時(shí)配制相同濃度梯度的VC溶液作為對(duì)照品進(jìn)行試驗(yàn)。

計(jì)算公式：

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化的吸光度隨時(shí)間的變化值；ΔAX為加入樣品后溶液的吸光度隨時(shí)間的變化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of flavonoids

由圖1 可以看出，隨著乙醇濃度的增大黃酮提取率也不斷增大，在乙醇濃度為60%時(shí)黃酮提取率達(dá)到最大值，乙醇濃度超過(guò)60%提取率反而降低，說(shuō)明百香果果殼中黃酮的極性與60%乙醇極性最接近，因此，可以最大程度地從固體材料中轉(zhuǎn)移到溶劑中。因此確定60%乙醇溶液為最佳提取溶劑。

2.1.2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出料液比對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of ratio of material to solvent on extraction efficiency of flavonoids

由圖2 可知，隨著料液比的不斷增大，黃酮的提取率也逐漸上升，當(dāng)料液比上升到1 ∶40（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后，提取率開(kāi)始下降。這可能是由于溶劑量的不斷增大，溶質(zhì)與溶劑之間接觸的表面積不斷增加，加速了溶質(zhì)的溶出，導(dǎo)致提取率增加。隨著溶劑量不斷加大到一定比例時(shí)，黃酮已經(jīng)基本完全從固體組織轉(zhuǎn)移到液體中。因此，試驗(yàn)選用1 ∶40（g/mL）的料液比作為最佳料液比。

2.1.3 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on extraction efficiency of flavonoids

由圖3 可知，隨著超聲功率的不斷增大，黃酮的提取率也不斷升高，在超聲功率240 W 時(shí)黃酮提取量最大，之后隨著功率的增加，提取率趨于平穩(wěn)。可能的原因?yàn)椋涸?60 W 到240 W 之間，隨著功率的增加，超聲波的能量不斷增大，分子運(yùn)動(dòng)不斷加快，導(dǎo)致黃酮的提取率增大；超聲功率超過(guò)240 W 后，過(guò)高的功率導(dǎo)致高溫，反而破壞了黃酮分子，導(dǎo)致黃酮提取率降低。因此，選取240 W 作為試驗(yàn)的最佳超聲功率。

2.1.4 超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction efficiency of flavonoids

從圖4 可以看出，黃酮提取率隨超聲溫度增大而不斷增大，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著溫度再升高提取率反而降低。這主要是因?yàn)槿軇┓肿舆\(yùn)動(dòng)速度與溫度正相關(guān)，溫度越高速度就越快。所以黃酮類溶質(zhì)分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加快，溶解速度增加，導(dǎo)致提取率不斷增加。而溫度超過(guò)一定極限后，黃酮類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致黃酮提取率降低，且溫度過(guò)高容易導(dǎo)致物質(zhì)活性喪失，因此選用60 ℃作為最佳提取溫度。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic time on extraction efficiency of flavonoids

由圖5 可知，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮提取率不斷增大，且在50 min 時(shí)達(dá)到最大值，之后變化趨于平穩(wěn)。這主要的原因是：溶劑提取有效成分的動(dòng)力是溶劑內(nèi)外存在濃度差，在提取的初始階段，濃度差較大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)有效成分會(huì)迅速進(jìn)入溶劑中，提取率就不斷增大；隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)濃度差會(huì)不斷減小，提取率就基本保持不變了。因此，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選取超聲時(shí)間50 min 為最佳提取時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，通過(guò)試驗(yàn)得出正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2 的極差分析可知，乙醇濃度對(duì)提取率的影響最大，各因素對(duì)黃酮提取效果影響的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋境暅囟龋境晻r(shí)間＞超聲功率＞料液比，最佳提取工藝條件為A3B1C2D2E2，即60 %乙醇，料液比1 ∶30（g/mL），超聲功率 240 W，超聲溫度 50 ℃，超聲時(shí)間40 min。

因?yàn)樽罴褏?shù)A3B1C2D2E2在正交試驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of verification test

從表3 可以看出驗(yàn)證試驗(yàn)中黃酮的提取率為8.084 0 mg/g，大于正交試驗(yàn)的最大黃酮提取率7.914 6 mg/g，說(shuō)明最佳提取工藝A3B1C2D2E2確為最佳。

對(duì)百香果果殼樣品進(jìn)行索氏提取，在90 ℃水浴鍋中采用60%乙醇提取，待虹吸5 次后結(jié)束提取，用時(shí)3 h 10 min，黃酮提取率為5.669 5 mg/g。明顯小于超聲提取法黃酮提取率8.084 0 mg/g。因此，與索式提取方法相比，超聲波輔助乙醇提取法具有用時(shí)更短，效率更高，成本更低等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 黃酮抗氧化活性的研究

2.3.1 水楊酸法測(cè)抗氧化活性

對(duì)不同濃度的黃酮提取物進(jìn)行水楊酸法測(cè)定抗氧化活性，以相同濃度的VC做對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 黃酮對(duì)·OH 的清除率的影響Fig.6 The effect of·OH clearance on flavonoids

由圖6 可知，隨著濃度的不斷增加，黃酮對(duì)·OH的清除率不斷升高，在試驗(yàn)范圍的最大濃度0.44 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到58.66%，而同濃度的VC在清除·OH 自由基能力方面要明顯小于黃酮，說(shuō)明百香果果殼中黃酮對(duì)羥自由基有較好的清除能力。

2.3.2 DPPH 法測(cè)抗氧化活性

對(duì)不同濃度的黃酮提取物進(jìn)行DPPH 法測(cè)定抗氧化活性，以相同濃度的VC做對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率的影響Fig.7 The effect of the scavenging rate of DPPH on flavonoids

由圖7 可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的不斷增加，對(duì)DPPH 自由基的清除率從54.7%增加到93.81%。與同濃度的VC相比較，黃酮的清除率小于VC的清除率（95.42%），但可以看出，在最大濃度時(shí)，百香果黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除能力接近于VC的清除水平。說(shuō)明黃酮對(duì)DPPH 自由基有很強(qiáng)的清除能力。

2.3.3 鄰苯三酚自氧化法測(cè)抗氧化活性

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品濃度為0.044 mg/mL 時(shí)，黃酮與VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除率高達(dá)100 %，無(wú)法做出比較。因此將樣品濃度繼續(xù)稀釋至0.026 4、0.017 6、0.008 8 mg/mL 3 個(gè)濃度梯度，黃酮與VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同濃度黃酮對(duì)O2-·的清除率的影響Fig.8 The effect of the clearance rate of O2-·on different concentrations of flavonoids

由圖8 可知，百香果果殼中的黃酮和VC都對(duì)O2-·有清除作用，且清除效果與添加的劑量成正相關(guān)，隨著樣品濃度的增加，對(duì)O2-·的清除率也隨著增大。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明黃酮清除O2-·自由基的能力略低于VC，但是黃酮的最大清除率仍然達(dá)到了82.61%，說(shuō)明黃酮在清除超氧陰離子自由基方面同樣表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)確定了超聲波輔助法提取黃酮的最佳工藝條件為50 ℃條件下，選擇60%乙醇為提取劑、料液比 1 ∶30（g/mL）、超聲 40 min，超聲功率 240 W，此條件下提取的百香果果殼黃酮含量可達(dá)8.084 mg/g。與傳統(tǒng)提取工藝相比，超聲波輔助法明顯提高了百香果果殼黃酮的提取效果和含量，提取效果優(yōu)于乙醇回流提取工藝，是一種高效、節(jié)能、省時(shí)的提取百香果果殼黃酮工藝。

提取后的樣品經(jīng)過(guò)聚酰胺層析柱純化，對(duì)純化的黃酮化合物利用水楊酸法測(cè)定對(duì)羥基自由基的清除能力、DPPH 法與鄰苯三酚自氧化法來(lái)測(cè)定超氧陰離子自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)黃酮濃度為0.44 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)58.66%；對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)93.81%；對(duì)超氧陰離子自由基的清除率甚至可達(dá)100%。相比較于同濃度的VC而言，黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于VC；對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)；對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力低于VC。試驗(yàn)結(jié)果證明了百香果果殼黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，是一種理想的天然抗氧化劑。