夏枯草總黃酮提取方法的比較*

鐘楚楚，趙晉彤，范 宇，劉浩真

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

夏枯草(PrunellaVulgarisL.)為藥食同源的多年生草本植物，可清肝散火、明目、消結(jié)散腫[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種藥理學(xué)活性[3]。夏枯草的主要活性成分之一是黃酮類化合物[4]，其具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及心血管保護(hù)等藥理作用[5-6]。鑒于總黃酮良好的藥理活性，本文對醇浸漬提取法、醇溶劑回流提取法、超聲輔助醇提取法提取夏枯草總黃酮，對夏枯草總黃酮的提取率進(jìn)行比較，以期找到最佳提取方法，并通過單因素和正交實驗法對超聲輔助醇提取法的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。該研究將為夏枯草總黃酮的提取及開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 儀器設(shè)備與試劑

夏枯草，哈爾濱信衡中藥材有限公司。

數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；循環(huán)水多用真空泵，邦西儀器科技(上海)有限公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

實驗所用試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品總黃酮含量測定

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用65%乙醇定容至100 mL容量瓶中，搖勻，備用。分別精確吸取0，1.0，2.0，4.0，6.0和8.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次放入1至6號25 mL容量瓶中，而后加入0.8 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，加入0.8 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，用65%乙醇定容至刻度，放置15 min后于510 nm處測定其吸光度[7]。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：A=8.343C+0.0122，R=0.9999。

吸取夏枯草提取液及供試品溶液適量，置于25 mL容量瓶中，按上述顯色方法顯色，于510 nm處測定其吸光度，并計算夏枯草總黃酮的提取率。

計算公式如下：

式中：C為計算出的夏枯草總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取溶液體積，mL；n為提取溶液稀釋倍數(shù)；m為所用夏枯草的質(zhì)量，g。

1.3 提取方法的確定

1.3.1 醇浸漬提取法

稱取夏枯草2.0 g，加入40 mL 65%乙醇，室溫下浸漬2 h，過濾。共提取2次后，合并濾液，定容至100 mL，備用。

1.3.2 醇溶劑回流提取法

稱取夏枯草2.0 g，加入40 mL 65%乙醇，水浴回流1.5 h，過濾。共提取2次后，合并濾液，定容至100 mL，備用。

1.3.3 超聲輔助醇提取法

稱取夏枯草2.0 g，加入40 mL 65%乙醇，超聲提取40 min，過濾。共提取2次后，合并濾液，定容至100 mL，備用。

1.4 超聲輔助醇提取法提取夏枯草總黃酮工藝條件的確定

1.4.1 單因素實驗

稱取夏枯草2.0 g，分別設(shè)定不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、45%、55%、65%、75%)，不同的提取時間(10、20、40、60、80 min)，不同的料液比(g/mL)(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)進(jìn)行單因素實驗，分別考察上述因素對夏枯草總黃酮提取率的影響。

1.4.2 正交實驗

在1.4.1節(jié)單因素實驗的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%、55%、65%)、提取時間(20、40、60 min)、料液比(g/mL)(1:20、1:25、1:30)作為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交實驗，以確定夏枯草總黃酮的最佳提取工藝，正交實驗因素水平如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal design

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的確定

在提取溶劑同為65%乙醇，料液比均為1:20的前提下，3種提取方法醇浸漬提取法、醇溶劑回流提取法、超聲輔助醇提取法對夏枯草總黃酮的提取率分別為4.22%、5.34%、5.96%。結(jié)果表明超聲輔助醇提取法對夏枯草總黃酮的提取率最高，因此繼續(xù)對該提取方法進(jìn)行單因素及正交實驗優(yōu)化工藝條件。

2.2 單因素實驗中各因素對夏枯草總黃酮提取率的影響

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在35%～55%范圍內(nèi)時，夏枯草總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時，提取率達(dá)到最高為5.83%，乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高，夏枯草總黃酮提取率反而開始逐漸下降。分析其原因可能因為乙醇濃度過高會溶出較多的脂溶性雜質(zhì)及親脂性強(qiáng)的成分，其與總黃酮競爭乙醇溶劑，間接地減少了總黃酮的溶出量，使得提取率下降。因此選取最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate

2.2.2 提取時間對提取率的影響

當(dāng)提取時間由20 min增加到40 min時，夏枯草總黃酮提取率由4.19%提高到最大值5.46%，之后隨提取時間的延長，提取率逐漸下降。分析其原因可能因為提取時間過長，導(dǎo)致部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而使夏枯草總黃酮的提取率下降。因此選取最優(yōu)提取時間為40 min。

圖2 提取時間對提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate

2.2.3 料液比對提取率的影響

在料液比為1:10～1:25范圍內(nèi)，提取率隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比為1:25時提取率達(dá)到最高值，而后隨著溶劑體積的增加，提取率下降。因此選取最優(yōu)料液比為1:25。

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of Solid-liquid ratio on extraction rate

2.3 正交實驗

根據(jù)表2實驗數(shù)據(jù)可知，影響夏枯草總黃酮提取率的因素依次為料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時間，最佳提取工藝條件組合為A3B1C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、提取時間為20 min、料液比為1:20，在此條件下夏枯草總黃酮的提取率為7.01%

表2 正交實驗結(jié)果直觀分析Table 2 The experimental results of orthogonal experiment

3 結(jié) 論

本實驗綜合比較了醇浸漬提取法、醇溶劑回流提取法、超聲輔助醇提取法對夏枯草總黃酮提取率的影響，結(jié)果表明超聲輔助醇提取法對夏枯草總黃酮的提取率最高，并通過單因素實驗及正交實驗優(yōu)選出該提取法的最佳工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、提取時間為20 min、料液比為1:20，在此條件下，夏枯草總黃酮提取率為7.01%，本研究為夏枯草總黃酮的提取及開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。