微系統(tǒng)中細(xì)胞分選方法淺析

李備，張來(lái)明，李文杰，楊暢

（1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林長(zhǎng)春130033；2.長(zhǎng)春長(zhǎng)光辰英生物科學(xué)儀器有限公司，吉林長(zhǎng)春 130033）

1 單細(xì)胞彈射分選技術(shù)

單細(xì)胞彈射分選技術(shù)是一種基于激光與物質(zhì)相互作用的精準(zhǔn)分離技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣本中單細(xì)胞的精準(zhǔn)分選與分離，具有可視化、無(wú)標(biāo)記、非接觸、準(zhǔn)確率高、廣泛適用等特點(diǎn)。如圖1所示，為單細(xì)胞彈射分選原理圖。將細(xì)胞群放置在分選新品上，然后翻轉(zhuǎn)，脈沖激光經(jīng)過(guò)倒置物鏡聚焦到樣品上，透過(guò)玻璃基板與介質(zhì)層的相互作用，將目標(biāo)細(xì)胞彈射下來(lái)。

圖1 單細(xì)胞彈射分選原理圖

單細(xì)胞彈射分選技術(shù)為環(huán)境、臨床等復(fù)雜生物樣本中的單細(xì)胞，特別是微生物分選提供了先進(jìn)可靠的工具。在醫(yī)療領(lǐng)域，單細(xì)胞精準(zhǔn)分選儀可通過(guò)單細(xì)胞智能識(shí)別及分選功能，從血液、尿液等成分復(fù)雜的臨床樣本中，快速定位并分離病原微生物，替代耗時(shí)長(zhǎng)的微生物純培養(yǎng)過(guò)程，大大縮短感染性疾病的致病菌診斷周期，從而指導(dǎo)用藥，為患者特別是重癥感染患者爭(zhēng)取黃金治療期，直接防止抗生素濫用。在生物制藥領(lǐng)域，單細(xì)胞精準(zhǔn)分選儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)具有特殊生理功能或代謝產(chǎn)物的工程微生物的快速篩選，縮短工程菌制備周期。如圖2所示，為單細(xì)胞彈射分選前后的細(xì)胞芯片顯微圖像和接收器顯微圖像。通過(guò)精準(zhǔn)單細(xì)胞分選過(guò)程，可以看見(jiàn)經(jīng)過(guò)分選的細(xì)胞處已經(jīng)沒(méi)有細(xì)胞，而在接收器中可觀(guān)察到細(xì)胞的存在。對(duì)比說(shuō)明了細(xì)胞的精準(zhǔn)分選。

圖2 單細(xì)胞彈射分選結(jié)果

單細(xì)胞研究在國(guó)內(nèi)外科研和成果產(chǎn)業(yè)化中逐步趨熱，必將是未來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)療、生物制藥、全民健康、環(huán)境資源等眾多行業(yè)的發(fā)展方向，為探索單細(xì)胞生命科學(xué)提供一個(gè)有效方法，為解密生命密碼提供一個(gè)有力工具。

2 微濾分離和分選

分選微粒最傳統(tǒng)的方法是微濾。該方法利用調(diào)整微孔的大小和微柱之間的間隙進(jìn)行分選。因此，微濾高度依賴(lài)于微粒的大小。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是易于操作人員理解分離原理（這并不意味著制造或?qū)嶒?yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單），并且易于添加到其他方法中。

另一種微流體細(xì)胞分離系統(tǒng)使用微柱作為全血細(xì)胞計(jì)數(shù)的過(guò)濾器。通過(guò)設(shè)計(jì)微柱與微柱大小之間的間隙，對(duì)微粒、血細(xì)胞進(jìn)行分選和分析。微通道有3個(gè)區(qū)域，對(duì)應(yīng)于有不同目標(biāo)大小的微粒。每一種微觀(guān)結(jié)構(gòu)都有一個(gè)凹槽來(lái)捕捉目標(biāo)微粒，并有一個(gè)小間隙連接凹槽，使小于目標(biāo)尺寸的微粒通過(guò)。

3 磁力

紅細(xì)胞的天然磁化率是由于血紅蛋白的存在（紅細(xì)胞中的脫氧血紅蛋白是順磁性的）。利用細(xì)胞的天然磁性，可以實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞與全血的分離。有研究人員[1]利用同樣的機(jī)制，報(bào)道了一種分離罕見(jiàn)有核紅細(xì)胞的微系統(tǒng)。為了改善以往復(fù)雜系統(tǒng)的缺陷（回收率低、細(xì)胞純度不理想），該研究采用磁性柱微流體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了從母體血液中高通量地分離稀有有核紅細(xì)胞（NRBCs）。

另一種方法（顆粒磁分選法）是利用包覆靶向特異性細(xì)胞膜抗原的磁性顆粒進(jìn)行分選。可以直接或間接地通過(guò)生物素、鏈霉親和素偶聯(lián)介導(dǎo)獲得抗體涂層。涂層后，粒子和細(xì)胞混合并孵育，在微流控系統(tǒng)中利用磁鐵可以快速回收。另一項(xiàng)研究表明，基于細(xì)胞的內(nèi)吞能力，納米顆粒被內(nèi)吞化后可以分離單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞能力差異較大[2]。

4 利用表面特性進(jìn)行分選

還有其他利用表面支撐物，如疏水性和化學(xué)鍵分離細(xì)胞的例子。為了從血細(xì)胞中分離白細(xì)胞和紅細(xì)胞，有研究者[3]在微通道中采用了雙水相層流的方法，利用不同細(xì)胞對(duì)于不同細(xì)胞溶液的不同疏水性，將聚乙二醇（PEG）等疏水細(xì)胞溶液或親水性細(xì)胞的右旋糖酐涂于微通道懸浮的血細(xì)胞上，誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。白細(xì)胞向PEG溶液移動(dòng)，紅細(xì)胞向右旋糖酐溶液移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)了用不同疏水性溶液分離兩親性細(xì)胞的目的。

CTCs是血液中漂浮的腫瘤細(xì)胞，可從原發(fā)腫瘤細(xì)胞中脫離，引起腫瘤轉(zhuǎn)移。檢查患者血液中CTCs的數(shù)量可以為癌癥的診斷提供一個(gè)很好的指標(biāo)。然而，檢測(cè)CTCs的主要問(wèn)題之一是血液中CTCs的數(shù)量非常少，轉(zhuǎn)移性疾病患者每毫升全血中僅觀(guān)察到1至10個(gè)細(xì)胞。因此，開(kāi)發(fā)CTCs分離技術(shù)是細(xì)胞分離研究的重要課題之一。為了檢測(cè)和分離CTCs，微系統(tǒng)需要具備以下能力：高流速、高分選精度、分離后CTCs的高存活率。錢(qián)伶琳等[4]提出了一種利用微柱的微流體平臺(tái)。該系統(tǒng)由靶CTCs與上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）包覆的微柱在精確控制的層流條件下相互作用，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記。通過(guò)對(duì)流速和剪切力兩個(gè)參數(shù)的控制，優(yōu)化了細(xì)胞-微柱接觸和細(xì)胞-微柱附著的持續(xù)時(shí)間。該系統(tǒng)能夠從轉(zhuǎn)移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌患者的外周血中鑒別出CTCs，準(zhǔn)確率達(dá)99%。

5 結(jié)語(yǔ)

本文介紹了4種基于物理原理的微米級(jí)分離系統(tǒng)及其在生物醫(yī)學(xué)和臨床病例中的應(yīng)用。任何細(xì)胞分離系統(tǒng)的重要目標(biāo)都是實(shí)現(xiàn)高精度和高通量的分離。細(xì)胞分離微系統(tǒng)的不斷發(fā)展將為診斷CTCs和癌癥轉(zhuǎn)移以及分析血液中的其他元素帶來(lái)新的機(jī)遇。因此，應(yīng)該擴(kuò)展細(xì)胞分選微系統(tǒng)，使其在醫(yī)學(xué)和生物領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。由于開(kāi)發(fā)人員和用戶(hù)（生物學(xué)家和臨床醫(yī)生）之間存在差距，阻礙了微系統(tǒng)向?qū)嶋H醫(yī)療的過(guò)渡進(jìn)程。因此，為了縮小差距，生物學(xué)家需要深入了解現(xiàn)有的傳統(tǒng)工具及其局限性，并將其與新工具結(jié)合起來(lái)，更詳細(xì)地揭示細(xì)胞特征，而工程師則需要改進(jìn)和開(kāi)發(fā)更加簡(jiǎn)單、直觀(guān)、用戶(hù)友好的新工具。