三唑磷對斑馬魚肝臟氧化損傷作用研究

李方敏，姚燦燦，丁存寶

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山063000）

三唑磷是一種廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑，主要被用來防治蠅類幼蟲、地下害蟲等，進(jìn)入水體后會毒害水生生物，并對水體環(huán)境造成長期的不良影響[1]。三唑磷在進(jìn)入生物體后，會刺激生物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生，使得活性氧自由基的數(shù)量迅速增加，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。生物體內(nèi)抗氧化體系的變化，對檢測、防治水污染具有重要意義[2]。不同的三唑磷濃度會對斑馬魚體內(nèi)的超氧化物歧化酶[3]、過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶等與活性氧自由基[4]清除相關(guān)的酶系統(tǒng)造成一定的影響。因此，本研究對這種影響進(jìn)行定量分析，為斑馬魚作為污染檢測指示生物提供理論依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

三唑磷試劑購買自北京鼎瑞（集團(tuán)）化工有限公司，配制成濃度為0.05 μL/L、0.50 μL/L、1.20 μL/L的溶液。

將購買的斑馬魚等量分為4組，每組50條，分別喂養(yǎng)在3種三唑磷濃度的小魚缸中，持續(xù)喂養(yǎng)4周。每周從各魚缸中取出10條斑馬魚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 勻漿制備

將斑馬魚放置在冰上，以達(dá)到迅速致死的效果；使用解剖鏡對斑馬魚進(jìn)行解剖，將肝臟取出，并準(zhǔn)確稱取肝臟的質(zhì)量；加入生理鹽水，在冰水浴條件下機(jī)械攪勻；在 2 500 r/min 條件下離心 10 min，取上清液，用生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，并進(jìn)行后續(xù)測定。

1.3 生理生化指標(biāo)測定

1.3.1 總蛋白含量采用測定（BCA法）

堿性條件下，待測樣品中的蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，Cu+和BCA試劑反應(yīng)，產(chǎn)生一種紫色絡(luò)合物，可于562 nm處測定吸光度值，并計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度。

1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）的測定（羥胺法）

黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的·O2可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，與顯色劑作用呈紫紅色，用可見光分光光度計(jì)測其吸光度。被測樣品中含SOD，會抑制·O2的產(chǎn)生，亞硝酸鹽的濃度因此降低。

1.3.3 過氧化氫酶（CAT）的測定

過氧化氫酶會分解過氧化氫，三唑磷的刺激會降低過氧化氫酶的活性，使得過氧化氫的含量增加，通過檢測過氧化氫的含量來測定過氧化氫酶。

1.3.4 脂質(zhì)過氧化（MDA）的測定（TBA法）

脂質(zhì)過氧化形成的丙二醛與硫代巴比妥酸進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，可通過測定紅色產(chǎn)物含量計(jì)算脂質(zhì)過氧化。

1.3.5 乙酰膽堿酯酶（AChE）的測定

AChE使乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，剩余乙酰膽堿與羥胺作用生成乙酰羥胺，再與鐵離子在酸性溶液中形成棕色復(fù)合物，可通過測定棕色復(fù)合物含量計(jì)算乙酰膽堿酯酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚活力及形態(tài)變化

斑馬魚體長 2～3 cm，體重約 0.3 g。前兩周，斑馬魚活力正常，進(jìn)食狀況良好。隨著時(shí)間的推移，三唑磷濃度為1.2 μL/L的浴缸中，斑馬魚開始出現(xiàn)進(jìn)食量減少、游動活力減弱的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)期間，3組斑馬魚均未出現(xiàn)死亡情況。

2.2 三唑磷對總蛋白含量的影響

分析圖1可知，三唑磷處理1周時(shí)，低濃度的三唑磷能夠適當(dāng)促進(jìn)總蛋白含量的提升，但隨三唑磷濃度的繼續(xù)升高，總蛋白含量會低于對照組；處理2、3、4周后，3個(gè)三唑磷處理組相較于空白對照組，總蛋白含量均呈現(xiàn)下降趨勢，但0.5 μL/L濃度的三唑磷對總蛋白含量影響最小。

圖1 三唑磷對斑馬魚總蛋白含量的影響

2.3 三唑磷對超氧化物歧化酶（SOD）的影響

分析圖2可知，隨著三唑磷農(nóng)藥濃度的升高，SOD比活力呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。三唑磷濃度為0.5 μL/L時(shí)，SOD的比活力最高；三唑磷濃度為1.2 μL/L時(shí)，SOD比活力降低。

圖2 三唑磷對斑馬魚SOD比活力的影響

2.4 三唑磷對過氧化氫酶（CAT）的影響

分析圖3可知，在前3周，隨著三唑磷農(nóng)藥濃度的升高，CAT的比活力表現(xiàn)為先升高后降低。三唑磷農(nóng)藥濃度為0.05 μL/L時(shí)，比活力升高幅度最為明顯，但是，隨著處理時(shí)間的加長，升高幅度會逐漸下降。在處理一周之后，對照組的CAT比活力值異常偏低。在第四周的時(shí)候，CAT的比活力先下降，后又升高，與前三周的情況正好相反。

2.5 三唑磷對脂質(zhì)過氧化（MDA）的影響

由圖4可知，經(jīng)過三唑磷處理之后，同對照組相比，丙二醛的含量迅速降低，且呈劑量依賴性。

圖3 三唑磷對斑馬魚CAT比活力的影響

圖4 三唑磷對斑馬魚MDA含量的影響

2.6 三唑磷對乙酰膽堿酯酶（AChE）的影響

分析圖5可知，在處理一周之后，三唑磷濃度為0.05 μL/L和1.2 μL/L的AChE比活力明顯下降，而三唑磷濃度為0.5 μL/L的AChE的比活力則升高。處理兩周之后，AChE的比活力均下降，并且隨著處理時(shí)間的加長，下降的幅度越來越大。

圖5 三唑磷對斑馬魚AChE比活力的影響

3 討論

超氧化物歧化酶的功能是清除活性氧自由基，能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)換為氧氣和過氧化物。將斑馬魚飼養(yǎng)在含有三唑磷農(nóng)藥的水中，斑馬魚的正常生長發(fā)育會受到影響，其體內(nèi)的活性氧自由基數(shù)量會迅速、大量地增加[6]，與清除活性氧自由基相關(guān)的酶系統(tǒng)的活性將會被激發(fā)。隨著刺激時(shí)間的加長，活性被激發(fā)得越徹底。但是，三唑磷濃度過高時(shí)，斑馬魚體內(nèi)的酶系統(tǒng)會遭到破壞，超氧化物歧化酶可能會失活，比活力將會下降。

動物肝臟中CAT的含量很高，其主要功能是催化生物體內(nèi)的過氧化氫發(fā)生反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化成分子氧和水[7]。隨著三唑磷刺激時(shí)間的加長、農(nóng)藥濃度的升高，CAT的活性會被抑制，甚至失活。試驗(yàn)中，三唑磷濃度為1.2 μL/L時(shí)，CAT的比活力呈現(xiàn)上升趨勢。

脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物是丙二醛。生成丙二醛之后，細(xì)胞膜的通透性會被破壞，流動性會降低。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子還能與丙二醛發(fā)生反應(yīng)，從而使其自身的結(jié)構(gòu)和功能被改變，細(xì)胞正常的代謝功能會受到阻礙[8]。

乙酰膽堿酯酶[9]（AChE）在生物體內(nèi)主要發(fā)揮解毒的功能，對三唑磷的存在有一定的指示作用。當(dāng)乙酰膽堿酯酶的抑制率達(dá)到20%時(shí)，就能證明毒害作用的存在。當(dāng)斑馬魚受到三唑磷的毒害作用時(shí)，乙酰膽堿酯酶的活性也會受到影響，會刺激具有解毒作用的AChE活性增強(qiáng)。隨著處理時(shí)間的加長，以及三唑磷濃度的增高，對蛋白酶的活性抑制作用也越來越強(qiáng)，AChE的量會減少，活性也會受到抑制。

4 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，隨著三唑磷濃度的升高，斑馬魚體內(nèi)的SOD、CAT比活力會呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢；MDA的含量會呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。根據(jù)這一結(jié)果，可以將斑馬魚作為污染檢測的指示生物。用待檢測的水處理斑馬魚，檢測斑馬魚體內(nèi)SOD、CAT、MDA的變化，如果符合上述變化趨勢，則說明水質(zhì)可能被某種農(nóng)藥污染。